非编码RNA与卒中后继发性脑损伤的研究进展

李进伟，田 力，薛维爽，陈汉泽，付开磊，滕伟禹*

·综述·

非编码RNA与卒中后继发性脑损伤的研究进展

李进伟1，田 力2，薛维爽1，陈汉泽1，付开磊1，滕伟禹1*

非编码RNA(ncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA，但在转录、翻译等过程中起着至关重要的调控作用，其功能尚未完全明确。脑卒中作为一类高死亡率、高致残率的疾病，ncRNA的出现为卒中的诊治提供了新的方向。本文旨在将近些年来ncRNA与卒中后继发性脑损伤的研究进展进行总结。

脑卒中；微小RNA；长链非编码RNA；环状RNA；与Piwi蛋白相互作用的RNA

0 引言

脑卒中(Cerebral stroke)主要包括缺血性卒中(Ischemic stroke)和出血性卒中(Hemorrhagic stroke)，其中缺血性卒中约占卒中的60%～80%。卒中是一类高发病率、高死亡率、高致残率的一组疾病，在我国占疾病死因首位，给社会带来了沉重的经济负担。由于目前没有有效的治疗手段，长久以来对于脑卒中的治疗，重在预防。近年来，随着神经免疫学的兴起，脑卒中后的炎症反应越来越受到广大神经科医生的重视。炎症反应在卒中后既起到促进血管再生等保护作用，也加重了卒中后脑组织的损伤。

非编码RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是指一类不编码蛋白质的RNA。广义的ncRNA包括核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、转运RNA(transfer RNA，tRNA)、核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)等作用机制比较明确的RNA，以及微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piwi-interacting RNA，piRNA)等未知功能的RNA。这些未知功能的ncRNA最早被认为是RNA酶剪切后的噪音。随着基因芯片与第二、三代测序技术的成熟，研究者发现，与正常人相比,患病人群这些ncRNA存在明显的差异性。而随着慢病毒等各种载体、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、crispr-cas 9基因敲除等技术的出现，越来越多的ncRNA被证实在转录及转录后调控中起到重要的作用。ncRNA与脑卒中后炎症反应、自噬、凋亡、神经再生等成为近年来的研究热点，本文对近年来ncRNA与卒中后继发性脑损伤的研究进展做一总结。

1 脑卒中后继发性脑损伤机制

脑梗死(Cerebral infarction)发生后，在缺血早期，脑血流减少，导致脑组织缺氧，细胞膜钠钾泵失调，细胞外钙离子缓冲系统失调，无氧糖酵解增加，产生过多的氧自由基及大量炎症因子直接对脑组织产生损伤。随后，随着血管再通及侧支循环的形成，缺血再灌注损伤也诱导了更为强大的炎症反应。最终导致脑、淋巴器官、血液循环等一系列的炎症级联反应，对缺血后的脑组织造成损伤[1]。

脑出血(Cerebral hemorrhage)后继发性脑损伤机制包括以下几种原因：①血肿及水肿的直接压迫，组织缺血，细胞坏死。②炎症反应对脑组织的损伤。脑出血后脑组织内存在中性粒细胞和巨噬细胞浸润，小胶质细胞激活和炎症因子参与的炎症反应[2]，炎症反应是脑水肿产生的重要因素，而脑水肿是ICH病情加重的关键所在，所以目前绝大多数的研究集中在如何减轻脑出血后炎症反应。③氧自由基生成对脑组织形成损伤。④脑组织与血肿相接触，启动内源性及外源性凝血途径，产生凝血酶，促进各种炎性细胞释放炎性因子。⑤细胞坏死凋亡。

近年来，随着动物及细胞实验技术的发展，鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型[3]、鼠脑出血模型[4]、细胞缺氧缺糖(Oxygen glucose deprivation，OGD)模型[5]等动物细胞模型的成熟，脑卒中后的损伤机制越来越多地在动物及细胞实验中被证实。

2 miRNA和卒中性疾病

miRNA是一种内源性非编码单链RNA，长度约为22～25 nt，具有很高的生物学保守性。miRNA由前体，即pri-miRNA经过2次修饰加工后形成。通过碱基互补配对与mRNA 3′端UTRs相结合，降解信使RNA(messenger RNA，mRNA)或抑制mRNA的翻译，从而起到转录调控作用。一种miRNA可以和多个mRNA相结合，而一个mRNA又有多个miRNA结合位点，生物学作用机制复杂。miRNA通过细胞分化、凋亡、再生、炎症等多种生物学途径，参与了生物体生长发育以及疾病的发展转归。

2.1 临床关于miRNA和卒中性疾病的研究 Guo等[6]选择16例脑出血患者、15例脑梗死患者以及8例健康人的血浆，通过基因芯片筛选出只在脑出血患者中过表达，并且在男性及女性患者中都存在的miRNA，定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)验证其中miR-27a、miR-365、miR-150、miR-34c-3p这4条miRNA，并通过机制分析认为其与炎症反应相关。Leunq等[7]在74例脑梗死及19例脑出血患者血浆中验证得到miR-124-3p 和miR-16两条microRNA，认为其可以作为生物学标志物(biomarker)鉴别脑出血及脑梗死。Zhu等[8]通过对3例脑出血患者及3例健康正常人的miRNA基因芯片筛选，并在30例患者及30例正常对照组中进行验证。与患者脑出血后CT影像学显示水肿范围做相关性分析，得出miR-126与脑出血后脑水肿密切相关。通过软件预测得到miR-126的靶基因位于VCAM1、SPRED1、PIK3R2，影响炎症通路并减轻出血后水肿。研究认为，mir-126可以作为预测脑出血预后的一种biomarker。Zheng等[9]选择脑出血后血肿扩大患者30例，脑出血后血肿不扩大患者49例及健康人30例，取患者外周血，通过基因芯片及qRT-PCR验证，得到在出血后血肿扩大患者中10个差异性表达的miRNA。认为这些miRNA可以作为出血后血肿扩大的预测因子。

2.2 动物及细胞实验关于miRNA和卒中性疾病的研究 Liu等[10]建立脑梗死及脑出血大鼠模型，取模型外周血与脑组织做miRNA测序分析，筛选出在脑组织及外周血中同时差异性表达的miRNA，其认为这些miRNA可以作为biomarker应用于临床。Zhao等[11]选取c57/bl6小鼠大脑皮层原位细胞，验证在脑出血后，miR-233可以通过和NLRP3 mRNA中3′UTR端含有保守的miR-223结合位点结合，下调NLRP3，通过caspase-1和IL-1β抑制炎症，减少脑水肿，改善神经功能，其认为miR-233可以作为治疗脑出血后水肿的一种新途径。Wang等[12]发现,在脑出血患者中，血清中miR-130a的表达量与血中周围水肿体积相关。通过建立大鼠脑出血模型，验证了这种关系。细胞实验证实，miR-130a可以通过下调牛窖蛋白-1(caveolin-1，cav-1)以及上调基质金属蛋白酶(Matrix metalloproleinase-2/9，MMP-2/9)影响出血周围水肿。Wang等[12]认为，miR-130a可以作为一种biomarker或者生物学治疗方式应用于临床中。

Kim等[13]在大鼠脑出血模型脑组织中发现Let7c存在差异性表达。在体外细胞实验及大鼠体内实验证实，脑出血后上调的Let7c可以通过IGF1R作用减少脑水肿和细胞损伤，从而达到减轻脑出血后脑水肿的治疗目的。

3 lncRNA和卒中性疾病

lncRNA长度200 nt，通常不编码蛋白质，但是在多种层面上参与转录编码、基因调控。lncRNA起初被认为是基因转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，没有生物学意义。然而，近年来大量的研究证实，lncRNA可以从多个层面调控基因表达。目前研究集中在以下几个方面：①调控表观遗传，如：参与DNA、RNA甲基化，修饰染色体结合蛋白等。②转录调控，lncRNA可以和转录因子结合，控制基因转录活性。③转录后调控，一些lncRNA还可以直接参与mRNA的转录后调控，影响基因的表达。④调控miRNA，起到海绵作用。

3.1 临床关于lncRNA和卒中性疾病的研究 Dykstra-Aiello等[14]通过对临床266个脑梗死患者外周血基因芯片筛查发现，男性中有44个、女性中有33个lncRNA显著变化。

INK4基因座中反义非编码RNA(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)，是一个由19个外显子组成的长链非编码RNA，位于9p21。Congrains等[15]综述显示，ANRIL在心血管疾病、阿尔兹海默病、2型糖尿病、青光眼、子宫内膜异位症及牙周炎中起到调控作用。Zhang等[16]通过对724例动脉粥样硬化斑块形成、466例腔梗、462例出血性卒中及1 664例对照组患者进行平均4.5年的随访观察发现，ANRIL与动脉粥样硬化血栓形成、出血性卒中易感性有关，并可以作为预测卒中复发及预后的生物学指标。

这些通过基因芯片、高通量测序等手段，在疾病中得到的差异性表达生物标记物，可以作为biomarker，预测疾病的发生、发展与预后，并指导基础实验进一步完善机制分析。

3.2 动物及细胞实验关于lncRNA和卒中性疾病的研究 lncRNA可以通过与染色质修饰蛋白相互作用，影响生物表观遗传学。Dharap等[17]用RNA免疫沉淀技术(RNA immunoprecipitation，RIP)，将脑缺血小鼠脑组织中与Sin3A和coREST形成RNA-蛋白质的复合物沉淀下来，通过芯片高通量分析，发现了177个与之相结合的lncRNA。这项研究表明，缺血性卒中后诱导的lncNRA，也可以与染色质修饰蛋白结合，调控梗死后生物表观遗传。Mehta等[18]研究发现，lcnRNA FosDT可以和REST相关性染色质修饰蛋白结合，促进梗死后脑组织损伤。

一些lncRNA在卒中后的组织损伤、细胞凋亡及细胞再生中起到转录调控作用。长期非编码RNA，转移相关肺腺癌转录物-1(lncRNA Malat1)，是一种预测肺癌预后的生物标志物。Zhang等[19]在OGD细胞模型、MCAO小鼠模型及LncRNA Malat1基因敲除鼠中证实，Malat1在脑微血管系统中发挥抗凋亡和抗炎作用，以减少缺血性脑血管和实质损伤。在另外一项研究中，Zhang等[20]在大鼠实验中证实，过表达的lncRNA ANRIL在脑梗死合并糖尿病中，激活NF-κB信号通路，上调VEGF并促进血管生成。Yan等[21]研究发现，lncRNA MEG3可以激活p53，调节脑梗后细胞凋亡。其通过在皮层神经元细胞和N2a 细胞完善机制分析，MCAO小鼠中完善qRT-CPR验证，对脑梗死小鼠做颅脑磁共振检查测得梗死面积，得出该结论，并认为lncRNA MEG3可以作为一个新的治疗靶点。Wu等[22]在动物实验中研究发现，lncRNA-N1LR可以通过调节p53磷酸化，在小鼠脑梗死后提高细胞周期，加快细胞增殖，从而改善症状。Zhang等[23]通过在OGD模型中筛出的lncRNA，在小鼠MCAO模型建模24 h后取得的血管内皮细胞中进行验证，发现这些内皮反应性lncRNA可能介导了内皮细胞对于缺血再灌注损伤的病理机制。

此外，lncRNA还可以通过与miRNA的内源竞争RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)机制，参与卒中后mRNA的转录。Chen等[24]在大鼠MCAO模型及细胞OGD模型中证实，lncRNA TUG1可以通过和microRNA-9的海绵机制，上调bcl2l11促进神经细胞凋亡。抑制lncRNA TUG1的表达，可能作为一种新的脑梗死后治疗靶点。

活化的小胶质细胞能够在脑梗死后释放大量的炎性因子，对脑组织造成损伤。Qi等[25]在MCAO及OGD模型中证实，lncRNA SNHG14通过抑制miR-145-5p增加PLA2G4A的表达，导致脑梗死中小胶质细胞的激活，从而造成脑损伤。抑制lncRNA SNHG14的表达，可以减少小胶质细胞的激活，从而减轻脑损伤。

自噬(Autophagy)是细胞吞噬自身蛋白质或细胞器并包入囊泡，并与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，降解其中的物质，达到细胞自身新陈代谢的目的，是近年来的研究热点。Wang等[26]通过对大鼠MCAO模型及SH-SY5Y细胞缺血缺氧处理后，实验验证得出lncRNA H19可以通过激活自噬，诱导脑梗死缺血再灌注损伤。

4 其他ncRNA和卒中性疾病

circRNA是一类双链闭合、无3′帽子结构及5′polyA尾、长度在几百至几千不等的非编码RNA。其不受RNA外切酶降解，稳定且广泛地存在于生物界，具有进化保守性。1976年，Sanger等[27]在高等植物中的类病毒里首先发现了circRNA的存在。2012年，Salzman等[28]发现，环状RNA广泛且稳定地存在于人类在内的真核世界。circRNA的主要作用机制是调节基因表达，具体机制包括：①miRNA的海绵作用[29]；②调控经典的RNA剪切；③与转录调控原件结合调控母基因转录。目前大多数研究主要集中在circRNA作为miRNA海绵作用这种机制。其中CDR1as(ciRS-7)[30]和SRY[29]作用机制比较明确。目前，circRNA的研究主要集中在肿瘤和神经退行性病变。缺血性及出血性卒中与circRNA的许多研究尚在进行中。Shao等[31]用HT22细胞建立OGD/R模型，通过circRNA芯片，发现3个在缺血再灌注后过表达、12个下调的circRNA，并用qRT-PCR验证了mmu-circRNA-015947。通过生物信息分析、GO分析及KEGG分析，其预测此circRNA可以通过和一些microRNA的海绵作用，影响缺血再灌注后细胞代谢、免疫反应及细胞凋亡。

piRNA是一种长度在24～31核苷酸的非编码RNA。物种之间缺乏保守性[32]。其功能和作用机制尚不明确，目前认为，piRNA可以通过控制反转录转座子的转录后沉默，防止基因突变，从而保证基因组的完整性[33]。piRNA被证实多存在于生殖细胞中。Dharap等[34]造成大鼠局灶性缺血后，通过基因芯片测得105个piRNA有显著差异。这些piRNA的转座子靶点分布在20个常染色体中。通过分析与这些piRNA基因位点有关的转录因子，推测这些转录因子通过沉默的方式起到调控作用。除Dharap等的研究之外，目前尚缺乏有关piRNA和脑卒中的研究。

5 总结与展望

ncRNA虽然不编码蛋白质，但是在转录、翻译、修饰等方面起到重要的调控作用。从人们开始认识到这些ncRNA具有作用到现在成为研究热点仅有短短十几年的时间。随着测序技术及基因芯片技术的发展，越来越多的ncRNA如siRNA、circRNA、piRNA被人们认识。这些ncRNA在预测疾病的发生、转归以及靶向治疗方面有着很大的潜力。希望ncRNA今后可以作为一种新的治疗靶点用于临床，减轻脑卒中对患者本人、家庭及社会所带来的沉重负担。

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Researchprogressofnon-codingRNAandsecondarybraininjuryafterstroke

LI Jin-wei1,TIAN Li2,XUE Wei-shuang1,CHEN Han-ze1,FU Kai-lei1,TENG Wei-yu1*

(1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Non-coding RNA is a class of RNA that does not encode protein,but plays a vital role in transcription,translation,and so on.However,its function is not yet clear.Stroke is a disease with high mortality and disability.The emergence of non-coding RNA provides a new way for the diagnosis and treatment of stroke.The aim of this study is to summarize the progress of ncRNA and secondary brain injury after stroke in recent years.

Cerebral stroke；miRNA；lncRNA；circRNA；piRNA

2017-07-16

1.中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳110001；2.中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004

辽宁省科学技术计划项目(2014226033)；沈阳市科技计划项目(F16-206-9-03)；中国医科大学附属盛京医院院内课题(ME63)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201711028