KSHV miRNA在卡波西肉瘤中的研究进展

张 静，吴秀娟，普雄明*

(1新疆医科大学附属中医医院病理科,乌鲁木齐 830000;2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:puxiongming@126.com)

KSHV miRNA在卡波西肉瘤中的研究进展

张 静1，吴秀娟2，普雄明2*

(1新疆医科大学附属中医医院病理科,乌鲁木齐 830000;2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:puxiongming@126.com)

卡波西肉瘤； 卡波西肉瘤相关病毒(KSHV)； KSHV miRNA

miRNA是一类长约23个核苷酸非编码的小分子RNA[1]。它广泛存在于多细胞生物中[2]。miRNA通过基因转录后与靶mRNA3′UTR互补结合,使靶mRNA降解或抑制蛋白质翻译[3]。它们参与信号转导、增殖、凋亡、侵袭或肿瘤血管形成[4，5],在肿瘤学、病毒学、神经生物学、胚胎发育等领域有许多成熟研究[6]。研究表明，miRNA参与了肿瘤相关的许多重要基因的表达。一方面miRNA特异地与抑癌基因转录的mRNA结合,抑癌基因功能受到抑制,导致肿瘤发生,miRNA起到促癌基因作用;另一方面miRNA特异地与促癌基因转录的mRNA结合,促癌基因功能受到抑制,控制肿瘤发生,miRNA起到抑癌基因的作用。

卡波西肉瘤(KS)是血管瘤样结构、梭形细胞增生的恶性肿瘤[7],卡波西肉瘤相关病毒(KSHV,即人疱疹病毒8型)由Chang等[8]首先从AIDS相关型KS患者的肉瘤组织中发现。随后,在各型的KS中均发现了KSHV的高表达。研究发现KSHV是卡波西肉瘤发生的必需因素和主要因素,与KS的发生关系密切。KSHV和大多数DNA病毒同样也编码多条miRNA[9],KSHV miRNA可以通过沉默转录因子、调控宿主细胞的细胞周期、生存环境等不同途径感染影响细胞的分化状态,最终导致KSHV诱导癌变的发生[10]。目前共发现25个KSHV编码的miRNA,吴秀娟等[11，12]对卡波西肉瘤肿瘤及瘤旁组织行miRNA检测后,发现13个KSHV编码的miRNA显著上调,未见下调的KSHV编码的miRNA,可见KSHV编码的miRNA促进了卡波西肉瘤的发生发展。KSHV miRNA很有可能成为卡波西肉瘤治疗的分子靶标。但它们的许多功能都未知,需要我们进一步研究探索。

1 KSHV编码的miRNA

miRNA做为一类特殊的调控分子已受到科学界的广泛关注。细胞的基因组能编码细胞的miRNA,一些病毒也能编码病毒的miRNA。迄今,已经发现至少有8种病毒能编码miRNA,并在细胞内加工成为成熟的miRNA。为了测定KSHV是否能编码miRNA,3个研究小组的科学家用经典的“RACE-like”克隆的方法:潜伏感染KSHV或者BC-1或者BCBL-1细胞株进行原位cDNA克隆,建立小RNA文库,发现代表11种独特小RNA与KSHV完全配对。随后,Grundhoff等[13]开发出新策略:计算机预测与微阵列分析相结合用来确认病毒编码候选miRNA,使用Northern blotting方法验证。用这种方法验证了11个之前已知的KSHV pre-miRNA,还发现一个在此之前没有被检测到的pre-miRNA,命名新的miRNA为KSHV-miR-K12-12。12条KSHV miRNA均来源于同一条称作“passenger”的链,而且方向相同。因此KSHV编码12个miRNA前体,通过经典的miRNA生物合成途径及不同剪接方式共产生25条成熟的miRNA[14],因为它们由12个miRNA前体产生而成,因此命名为miRNA-K12-1到miRNA-K12-12(如kshv-miR-K12-4-3p、kshv-miR-K12-4-5p),简称为miRNA-K1到miRNA-K12。Hansen等[11]也在对Kaposics肉瘤功能性改变的研究中发现存在KSHV编码miRNA。

2 KSHV miRNA的表达及功能

2.1 KSHV miRNA在潜伏期和裂解期的表达

研究发现KSHV编码的有些miRNA会在病毒潜伏期持续表达,如我们发现miR-K12-11在转录后下调天然免疫通路中IKKε的表达,阻断IKKε介导的IRF3/7磷酸化,部分抑制Ⅰ型干扰素通路的激活用来逃避宿主细胞抗病毒的天然免疫作用,稳定KSHV的潜伏感染,因此miR-K12-11在KSHV潜伏感染期可能发挥重要作用。

进一步的研究证明:KSHV编码的miRNA都簇集于KSHV基因组的主要潜伏相关区域,此区域编码潜伏相关性核抗原为LANA、v-cyclin、v-FLIP和Kaposi基因(K12)。两条miRNA(miR-K12-10,miR-K12-12)位于K12开放读码框架内,余10条簇集于v-FLIP与K12之间的非编码区域。KSHV基因组编码80多种蛋白质,只有少数在潜伏感染的细胞中表达,如上面所提到的LANA,v-Cyclin,v-Flip和K12。它们具有调节KS细胞宿主内环境作用,并与KSHV miRNA协同表达。

同时在对KSHV裂解复制开关分子RTA的3′UTR报告基因活性实验发现:miR-K12-7-5P能特异地下调RTA的活性,抑制它的表达。同时显著抑制RTA下游病毒裂解期基因的转录和病毒粒子的释放,之后在病毒裂解感染期检测到某些特定miRNA的表达增高,而且其表达水平比潜伏期更高[15]。说明潜伏期和裂解期相关miRNA的表达均在KSHV致病机制中发挥重要作用。呈现出潜伏性和裂解性两种阶段[16],它们之间的转换则是卡波西肉瘤发生的关键步骤[17]。

2.2 KSHV miRNA的功能

目前12种KSHV miRNA的功能大部分未知,Marshall等[18]研究了12种KSHV miRNA的进化保守性:miR-K12-2、-4、-5、-6、-7、-9具有相对明显的多态性;miR-K12-12完全保守;miR-K12-1、-3、-8、-10、-11高度保守。其中miR-K12-5的多态性影响成熟miRNA的表达水平和生物活性。miRNA-K12-9表现为更大的变异性,这说明miR-K12-9并非是组织培养中生长所必需的。

Marshall等[18]的实验数据表明:KSHV miRNA基因在体内严格选择,可能参与KSHV相关性恶性肿瘤的生物活性及发病机制,KS肉瘤中,被KSHV感染的肿瘤细胞都为低分化的内皮细胞,内皮细胞根据组织起源分为LECs和血管内皮细胞。Hansen等[19]证明了这些miRNA通过促进病毒介导的细胞重组,在LECs中沉默转录因子表达,从而维持分化状态的LECs,导致KSHV诱导KS的发生。同时Pun等[20]通过对KSHV编码的病毒FLICE9的研究发现:KHSV的感染以及K13的异位表达抑制了CXCR4的表达,而这种抑制作用与miR-146a的上调表达有关。研究人员[21]对2种位于miR-146a启动子上的NF-JB位点进行了研究发现:K13可能对这2个位点的激活是必需的。因此通过上调miR-146a,K13诱导的NF-JB活化抑制CXCR4的表达可能通过促进KSHV感染的内皮前体细胞过早释放到血液循环参与了KS的发展。

3 KSHV miRNA与靶基因

为了验证KSHV miRNA的靶基因的存在,Samols等[22]在293细胞中扩增表达KSHV miRNA,结果显示:在miRNA的存在作用下81个基因发生表达变化:表现上调的有8个基因;表达下调的有65个基因。其中明显下调的有8个基因,变化大于4倍。其中4个基因THBS1、SPP1、PRG1、S100A2分别具有免疫调节、细胞增殖、细胞程序性死亡和血管生成的作用。通过实验分析,证实3个基因(SPP1、PRG1、THBS1)的变化依赖miRNA调节,其中THBS1下调水平>10倍。值得一提的是,THBS1拥有34个与KSHV miRNA结合的预测位点,理论上12 KSHV miRNA都可以与THBS1结合,这意味着THBS1的抑制对KSHV生物活性非常重要。THBS1被确认是一个抑癌基因,其蛋白质具有抗血管生成作用,是血管发生、迁移、细胞粘连的重要调节因子。THBS1蛋白部分作用可激活TGF-β信号通路途径,THBS1蛋白水平的降低导致TGF-β活性的降低。KSHV miRNA对THBS1的下调,直接参与KS的发病机制。

KSHV和其他致癌病毒相同,通过阻止细胞凋亡、促进病毒逃逸、篡改信号传导通路、干扰宿主正常细胞周期等多环节促进肿瘤发生。如miR-K1靶向调节生长抑制信号通路(CDK1)P21的表达,抑制P21介导的细胞周期阻滞[23]。最近有报道某些miRNA能够直接结合到P21和另一种CDK1(P21)的3′UTR,但在KSHV整个感染过程这些miRNA持续表达所呈现的功能并未阐明[24]。miR-K1在氧应激条件下可下调靶基因BACH1促进细胞生存[25],miR-K1、miR-K3和miR-K4-3p可直接作用于靶基因Caspase3[26],研究还发现miR-K12-11能特异下调靶基因SMAD5的表达[27],抑制TGF-β信号的转导及其对细胞增殖的抑制作用,从而参与KSHV的促细胞增殖作用。

4 展望

许多动物病毒家族的基因表达产物(蛋白质、smallRNA)被证实可以抑制RNA通路和miRNA增殖,可以设想miRNA、蛋白、基因之间存在三角调节关系,组成复杂的基因表达网络调控系统。KSHV是KS必不可少的发病因素,寻找KS的发病机制更多应从KSHV入手,鉴于KSHV miRNA和其他病毒miRNA的研究结果可以看出:KSHV miRNA一方面可以调控本身基因,另一方面也可以调控宿主基因。同理,宿主的miRNA也可以调控病毒的基因。所以KS的发病机制有几种可能路径:①KSHV miRNA调控的本身抑癌基因,在KS病人中裂解的KSHV表达更多的miRNA促使抑癌基因表达降低,病毒促癌基因表达上调;②不是所有病毒基因都受自身编码的miRNA控制,那些不受控制的病毒基因可能和宿主的mRNA竞争结合宿主的miRNA,引起宿主mRNA上调表达产物,导致生物效应发生;③宿主的抑癌基因被KSHV miRNA所调控,同以上两种方式比较,这种调控更有意义、更直接。研究表明:miRNA在细胞程序性凋亡、肿瘤发生中确实起到重要作用,因此KSHV miRNA有可能参与病毒致病形成。我们对大部分的miRNA的功能了解甚少,说明我们探索领域十分广阔,基于KSHV miRNA在介导病毒-宿主相互作用中的重要作用以及多种miRNA功能研究的不断清晰,相信在KSHV相关的KS的攻克治疗中miRNA很有希望成为新兴的治疗靶点之一。

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国家自然科学基金面上项目(81660454)

张静,女,1979-12生,在读博士,主治医师,E-mail:565992809@qq.com

2017-03-27

R730.269

A

1007-6611(2017)07-0743-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.024