胰岛素通过SCF/KIT信号通路延缓或防止糖尿病小鼠便秘

张国权,王 宇,金 迅,李 辉,江 涛*

(1武警后勤学院人体解剖与组织胚胎学教研室,天津 300309;2兰州医科大学第二附属医院血管外科;*通讯作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

胰岛素通过SCF/KIT信号通路延缓或防止糖尿病小鼠便秘

张国权1,王 宇2,金 迅1,李 辉1,江 涛1*

(1武警后勤学院人体解剖与组织胚胎学教研室,天津 300309;2兰州医科大学第二附属医院血管外科;*通讯作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

目的 观察胰岛素对糖尿病便秘的作用,探讨其可能机制。 方法 选用生后7-8周的雄性BALB/c小鼠,腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,将小鼠分为:胰岛素组、模型组以及对照组,每组15只。胰岛素组小鼠在糖尿病造模成功后即每日给予胰岛素进行治疗,而对照组则每日给予同体积的柠檬酸缓冲液。各组小鼠均在糖尿病造模成功8周后取结肠,测量结肠内存留粪便的质量以及结肠纵行肌条收缩张力;制备全层铺片进行Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)免疫荧光染色;Western blot检测ICC细胞KIT受体及其配体SCF的蛋白表达。 结果 糖尿病8周时,模型组小鼠结肠内存留的粪便增加,肌层收缩强度明显减弱,ICC数量减少,细胞网络结构破坏,肌层KIT及SCF的蛋白表达减少,各项指标与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。胰岛素组小鼠结肠内存留的粪便减少,肌层收缩强度显著增强,ICC数量和KIT及SCF的蛋白表达均显著升高,各项指标与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。 结论 糖尿病早期给予胰岛素治疗可以阻止结肠ICC细胞和SCF蛋白表达的缺失,通过调控SCF/KIT信号,改善结肠收缩力,从而延缓或防止糖尿病便秘的发生。

胰岛素; 糖尿病; 便秘; 结肠动力； SCF/KIT信号道路

糖尿病是发病率较高的一种代谢性疾病,其发病率呈逐年升高的趋势。有调查显示,6%-83%的糖尿病人出现胃肠动力学性状的改变,表现为吞咽困难,进食返流,早饱,恶心,呕吐,腹痛或者便秘等临床症状[1],其中便秘是最常见的糖尿病胃肠道并发症[2]。虽然糖尿病便秘本身并不危及患者生命,但严重影响患者的生活质量,影响病人的血糖控制。有关糖尿病便秘的发病原因,目前还不完全清楚。近年来越来越多的证据显示,Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)与胃肠运动功能障碍性疾病的发生发展密切相关。ICC作为胃肠自主节律性运动的起搏细胞,普遍分布于哺乳动物的消化管壁内[3]。当ICC数量减少,细胞网络结构被破坏时,患者可出现胃肠动力学改变的各种临床表现[4]。在ICC的细胞膜上有KIT受体,该受体的天然配体是干细胞因子(stem cell factor,SCF),任何原因导致的SCF/KIT信号通路障碍,均可影响ICC的存活和功能,进而引起胃肠运动功能障碍性疾病[5]。

目前有研究认为,对于糖尿病患者早期应用胰岛素治疗,可能预防或延缓各种并发症的发生发展[6]。因此,本研究重点关注早期应用胰岛素对糖尿病小鼠便秘的作用以及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 糖尿病小鼠模型的制备和分组

选用生后7-8周健康雄性BALB/c小鼠,体质量22-26 g(购于北京军事医学科学院实验动物中心,SPF级),经过1周的适应以后,开始糖尿病造模。造模前15 h小鼠禁食,自由饮水。造模时一次性腹腔注射链脲佐菌素(购自Sigma公司,No.S0130),剂量为200 mg/kg体质量,造模后72 h用血糖仪(ACCU-CHEK®Active,Roche)测定小鼠的空腹血糖,血糖水平高于11.1 mmol/L被认为糖尿病造模成功,血糖不高者弃用。将糖尿病小鼠随机分为模型组和胰岛素组,每组15只。胰岛素组小鼠,从测定血糖升高时每日腹腔注射胰岛素治疗(诺和灵N,精蛋白生物合成人胰岛素注射液,丹麦诺和诺德公司,批号CVG0129),剂量为2.4 IU/只。选用同批次同体质量的15只小鼠,腹腔注射同体积的柠檬酸缓冲液作为对照组。对照组、模型组和胰岛素组小鼠均在糖尿病造模成功8周后取结肠,测量结肠内存留粪便的质量和结肠长度,并进行后续实验。

1.2 结肠纵行肌条收缩张力的测定

将小鼠断颈处死,迅速取出结肠置于预冷并充氧的Kreb’s液,沿系膜侧剪开,去除结肠内容物并彻底清洗内表面。取结肠中段纵行肌条(2 mm×10 mm),置于盛有8 ml Kreb’s液的器官浴槽内,水浴温度维持在37 ℃,持续通入95%O2/5%CO2的混合气体。将肌条固定于张力换能器,给予初始张力为1 000 mg,肌条在器官浴槽内平衡60 min,待自发节律性运动稳定后,张力反应被与计算机相连的应变仪连续记录(Powerlab biology signal recording system;AD Instruments, Bella Vista,NSW,Australia)。以单位时间内运动张力曲线面积(运动指数)为检测单位(mg×1 min)。

1.3 全层铺片的制备

将小鼠处死后,快速取出完整结肠,用预冷的0.01 mol/L PBS冲洗去除腔内容物。结扎结肠的一端,用注射器将预冷的丙酮注入结肠腔内,使其维持最大充盈状态,再结扎另一端,置入相同固定液中固定24 h。实验前去除结扎部分,沿系膜缘剪开肠管,取0.5 cm×0.5 cm大小的样本,置于平皿中,黏膜面向上。在解剖显微镜下,用眼科镊依次将黏膜层、黏膜下层剥离,再将环行平滑肌层与纵行平滑肌撕开,并剪成适当大小的标本块,置于预冷的0.01 mol/L PBS中4 ℃保存备用。

1.4 免疫荧光染色检测ICC的数量及分布

将制备好的全层铺片标本置于装有0.01 mol/L PBS的6孔板中漂洗3次,然后用0.3% Triton-X 100漂洗10 min,再以1% BSA室温孵育1 h以降低非特异性,弃去多余的孵育液,滴加0.1% BSA稀释的一抗(大鼠抗小鼠ACK2,稀释度1 ∶200,购自eBioscience公司),室温下湿盒内孵育1 h,4 ℃过夜。漂洗3次,再滴加0.1% BSA稀释的二抗(Cy3标记的羊抗大鼠IgG,稀释度1 ∶200,购自Invitrogen公司),湿盒内室温避光孵育1 h;漂洗3次,水溶性荧光封片剂封片,荧光显微镜观察。

1.5 Western blot检测结肠肌层KIT及SCF蛋白表达

1.6 ICC细胞计数

全层铺片免疫荧光染色用荧光显微镜(Nikon 80i,日本)观察并拍照。每组取5只动物,每个动物计数10个视野,用Image-Plus Pro 6.0软件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)计数ICC细胞。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 结肠长度与存留粪便的质量

糖尿病造模成功8周时,与对照组相比,模型组小鼠结肠长度(cm)显著增长(6.2±0.8vs9.8±0.8,P<0.01),同时肠内存留的粪便质量(g)也增加(1.6±0.8vs5.4±1.0,P<0.01)。而与模型组相比,胰岛素组小鼠结肠长度(7.5±0.5)显著缩短(P<0.01),结肠内存留的粪便质量(3.3±0.6)也相应的减少(P<0.05),差异有统计学意义(见图1)。

图1 小鼠结肠长度与存留粪便的质量变化Figure 1 The alteration of colonic length and remaining faeces in the mice

2.2 离体结肠纵行肌条收缩张力的测定结果

与对照组相比,模型组小鼠在糖尿病造模成功8周时,离体结肠纵行肌条收缩强度明显减弱(226.0±20.7vs92.0±19.2,P<0.01,n=5)。而在糖尿病早期给予胰岛素治疗后,小鼠结肠肌层收缩强度(216.0±20.7)显著升高大于模型组且差异有统计学意义(P<0.01,n=5,见图2)。

2.3 结肠ICC全层铺片免疫荧光染色结果

结肠ICC根据细胞所在位置可以分为以下类型:肌内ICC(intramuscular ICC,ICC-IM),位于环行肌与纵行肌之内;肌间神经丛周围的ICC(myenteric ICC,ICC-MY),位于环行肌与纵行肌之间的肌间神经丛周围;黏膜下ICC(submucosal ICC,ICC-SM),位于黏膜下层,紧贴环行肌的内表面。全层铺片免疫荧光染色结果发现,对照组ICC的突起反复分支，彼此连接形成独立的细胞网络；而模型组ICC细胞网络结构破坏，细胞突起间形成较为稀疏的网络；给予胰岛素治疗后，ICC细胞网络结构恢复正常(见图3)。与对照组相比,糖尿病造模成功8周时,模型组小鼠结肠壁内ICC-IM、ICC-MY、ICC-SM的数量均明显减少(P<0.01),细胞网络结构破坏。而早期给予胰岛素治疗后,这三个部位的ICC数量均又显著增加,与糖尿病模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01,见表1)。

2.4 Western blot检测结肠肌层KIT及SCF蛋白表达结果

电泳结果显示,与对照组相比,糖尿病造模成功8周时,模型组小鼠结肠肌层KIT蛋白表达减少

图2 小鼠离体结肠纵行肌条收缩张力的测定Figure 2 The measurement of contractile tension of isolated colonic longitudinal muscle strips in the mice

图3 结肠ICC全层铺片免疫荧光染色Figure 3 Immunofluorescent staining of ICC labeled with ACK2 on whole mount preparation of the mice colon

组别 ICC⁃IM ICC⁃MY ICC⁃SM对照组 41900±453374680±462759800±3834模型组 24920±4531##50200±6300##12860±2569##胰岛素组40000±4528∗∗73260±5054∗∗52660±3497∗∗

与对照组比较，##P<0.01；与模型组相比,**P<0.01

(0.91±0.09vs0.29±0.07,P<0.01),而作为KIT蛋白的天然配体,干细胞因子(SCF)的表达也相应减少(1.05±0.11vs0.43±0.08,P<0.01)。而早期给予胰岛素治疗后,KIT及SCF的蛋白表达水平均显著升高(KIT蛋白0.77±0.10,SCF蛋白0.95±0.10),与糖尿病模型组相比,差异均有统计学意义(P<0.01,见图4)。

图4 Western Blot检测结肠KIT及SCF蛋白表达Figure 4 Western blot analysis of the expression levels of KIT and SCF proteins in the colon muscle layer

3 讨论

有文献报道,小鼠糖尿病胃轻瘫等糖尿病胃肠道并发症一般是在糖尿病发病的4-5周时出现,最晚是在第8周时出现[7]。我们的研究也发现,在糖尿病造模成功8周后,模型组小鼠结肠收缩张力减弱,结肠内存留的粪便增多,结肠长度增加,出现糖尿病便秘的症状。而在糖尿病早期就给予胰岛素治疗后,小鼠结肠未见明显的便秘症状,提示胰岛素可以延迟或者预防糖尿病便秘的发生。

胃肠道蠕动与Cajal间质细胞(ICC)密切相关,ICC普遍分布于哺乳动物的消化管壁内,但不同器官的ICC分布存在一定差异。在结肠壁有3种ICC,即ICC-IM,ICC-MY和ICC-SM,其中ICC-MY和ICC-SM被认为具有起搏功能[8,9],可产生电慢波并通过缝隙连接传递给相邻的ICC和平滑肌,引发平滑肌机械性收缩。而ICC-IM作为一种传递介质,可将神经兴奋从肠神经系统传递给平滑肌细胞[10]。

酪氨酸激酶受体KIT是由原癌基因c-kit编码的一种跨膜蛋白,通常表达于多种细胞,如造血干细胞、肥大细胞、精原细胞、黑色素细胞及ICC等。而在哺乳动物胃肠道的肌层,KIT主要标记于ICC,胃肠道的平滑肌能够产生KIT受体的天然配体干细胞因子(SCF),SCF与KIT受体胞外段结合后,诱导其特定部位的酪氨酸残基自体磷酸化,并导致PI3K/Akt,Ras/MAPK和STAT等信号途径的激活[11]。研究发现,SCF/KIT信号通路对体外培养的ICC和哺乳动物ICC的存活、分裂、增殖、分化、以及数量的维持有重要的调控作用[12,13]。任何原因导致的胃肠道ICC的数量减少、网络结构的破坏或SCF/KIT信号通路受损,都会引起胃肠动力学异常。到糖尿病第8周时,模型组结肠壁内不仅具有起搏功能的ICC-MY和ICC-SM数量减少,同时作为传递介质的ICC-IM数量也相应的减少,细胞网络结构破坏,KIT和SCF的蛋白表达降低,SCF/KIT信号通路出现异常,这与以往的文献报道基本一致[14,15]。ICC的这些变化和信号系统的异常可能是导致糖尿病时结肠平滑肌收缩张力减弱,肠腔内粪便堆积增加以及结肠的长度增加的主要原因。

关于糖尿病时胃肠道病变的机制,有研究认为,高血糖是糖尿病胃肠道病变时ICC异常改变的重要机制之一,Lin等[16]发现糖尿病小鼠结肠ICC的异常不是由于高血糖所致,而是由于内源性SCF的缺失,给予外源性的SCF后可以部分恢复糖尿病小鼠结肠壁内ICC的病理改变。Horvth等[17]也认为在糖尿病相关的胃肠道病变中,ICC的缺失不可能是由于慢性或复发性的高血糖所致,而是由于胰岛素(insulin)/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)相关信号的转导障碍所致。在BALB/c小鼠胃肌层的体外培养中,若在培养基中加入胰岛素或IGF-1,则可以完全阻止ICC的减少和维持胃ICC的电慢波[17],这些结果提示ICC数量和电活动的正常维持,需要胰岛素或IGF-I。然而Horvth等[18]进一步研究发现,小鼠胃ICC不表达SCF,也不表达Insulin/IGF-1受体,而胃平滑肌不仅表达Insulin/IGF-1受体,同时也可产生SCF。小鼠胃ICC的存活依靠SCF信号,但是ICC也需要Insulin/IGF-1的维持,这就提示SCF能够介导Insulin/IGF-1的作用。在器官培养时,给予Insulin/IGF-1不仅可以阻止ICC的缺失同时也伴有平滑肌以及SCF表达的恢复,而且IGF-1是以浓度依赖和时间依赖的方式刺激结肠平滑肌细胞内SCF的表达[19],所以我们在糖尿病早期应用胰岛素治疗,可能使得胰岛素与结肠平滑肌细胞上的胰岛素受体结合,通过一系列信号途径(可能是ERK/MAPK信号传导通路[20])促进平滑肌细胞对SCF的表达,后者再通过SCF/KIT信号,维持ICC的数量和网络结构的正常,使结肠平滑肌保持正常的收缩张力,这些结果提示糖尿病时早期给予胰岛素治疗可能会延迟或预防便秘的发生,但胰岛素对于长期信号紊乱即已经发生的糖尿病结肠并发症的治疗效果还需要进一步探讨。

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Insulin delays/prevents diabetic constipation by SCF/KIT signaling pathway in BALB/c mice

ZHANG Guoquan1,WANG Yu2,JIN Xun1,LI Hui1,JIANG Tao1*

(1DepartmentofHistologyandEmbryology,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300309,China;2DepartmentofVascularSurgery,SecondAffiliatedHospital,LanzhouMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

ObjectiveTo observe the effect of insulin on diabetic constipation in mice and investigate its possible mechanism.MethodsMale BALB/c mice(7-8 weeks old)were selected. The mice were divided into three groups(n=15 for each): insulin group, model group and control group. The mice were intraperitoneally injected with streptozotocin to induce the diabetic model. The mice were administered with insulin daily after the model was induced successfully in insulin group, whereas the mice in control group were given the same volume of citrate buffer solution. The colon was collected at 8 week after the modeling, and then the residual feces and contraction tension of longitudinal muscle strip were measured. ICC quantities were analyzed by immunofluorescent staining in whole mount preparation. KIT and SCF protein expression in colonic muscle layer was detected by Western blot.ResultsAt 8 week after modeling, the residual feces increased, the smooth muscle contractile tension decreased, the ICC decreased, the cellular network was damaged, and KIT and SCF protein expression reduced in model group, and all these indexes was significantly different between model group and control group(P<0.01). Compared with model group, the residual feces decreased in insulin group, the smooth muscle contractility increased in the colon, ICC and KIT and SCF protein expression increased(P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe results suggest that early insulin treatment in diabetic mice could prevent depletion of ICC and reduction of SCF protein expression, and ameliorate the colon contractility by regulating SCF/KIT signaling, consequently prevent or delay the development of diabetic constipation.

insulin; diabetes; constipation; colonic motility; SCF/KIT signaling pathway

国家自然科学基金资助项目(31570985);武警后勤学院博士启动金资助项目(WHB201304)

张国权,男,1973-01生,博士,副教授,E-mail:zhangguoquan2005@163.com

2017-03-21

R587.2

A

1007-6611(2017)07-0665-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.006