HPLC法测定杏苏散提取物中活性成分苦杏仁苷和迷迭香酸含量

2017-04-01时庆欣张盛王玄源湖北中医药大学药学院湖北武汉430065

长江大学学报(自科版) 2017年4期

关键词：煎液分析方法波长

时庆欣，张盛，王玄源(湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

丁建中 (长江大学医学院，湖北荆州 434023)

宋成武，苏明武，黄荣增 (湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

HPLC法测定杏苏散提取物中活性成分苦杏仁苷和迷迭香酸含量

时庆欣，张盛，王玄源
(湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

丁建中
(长江大学医学院，湖北荆州 434023)

宋成武，苏明武，黄荣增
(湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

目的：采用反相高效液相色谱双波长法测定杏苏散水提液中苦杏仁苷和迷迭香酸的含量。方法：采用色谱柱为HPLC反向C18色谱柱 (4.6mm×250mm, 5μm)梯度洗脱，双波长为λ1=222nm，λ2=330nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。结果：苦杏仁苷对照品线性关系良好，r=0.9999，回归方程为Y=27.390X+0.0522，线性范围为0.08～0.64μg；迷迭香酸对照品线性关系良好，r=0.9997，回归方程为Y=26.141X+0.0905，线性范围为0.04～0.32μg。苦杏仁苷平均加样回收率为98.59%，RSD=1.6%(n=6)；苦杏仁苷平均加样回收率为98.86%，RSD=2.1%(n=6)。结论：方法简便、准确、重现性好，为杏苏散的质量控制和评价提供了一定的科学依据。

杏苏散；苦杏仁苷；迷迭香酸；反相高效液相色谱法；双波长法

杏苏散为我国经典中药复方，具有轻宣凉燥，理肺化痰之功效，主要用于治疗上呼吸道感染、慢性支气管炎。该方出自吴鞠通的《温病条辨.中秋燥胜气论》，其中苦杏仁和紫苏为复方中的重要组成药物[1]。苦杏仁苷和迷迭香酸分别是中药苦杏仁和紫苏叶中的指标性活性成分，具有众多药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药效作用[2～4]。

双波长法和反相高效液相色谱法是中药及其复方中有效成分质量控制最为常用的方法[5～7]。因此，本研究利用该方法构建杏苏散水煎液中的两种功效性成分(苦杏仁苷和迷迭香酸)的定量分析方法，进一步为该复方制剂的质量控制提供有效的分析检测手段。

1 仪器与试剂

复方中所有药材均购自湖北清大中药饮片有限责任公司，经湖北中医药大学生药教研室鉴定。迷迭香酸标准品和苦杏仁苷标准品购自中国药品生物检定所。HPLC设备为Dionex-P680型号高效液相色谱仪乙腈为色谱纯，流动相试剂甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher)、分析纯甲酸购自国药集团，色谱用纯净水自制。

2 方法与结果

2.1 对照品和样品溶液的制备

1)杏苏散水煎液 10倍量水煎煮提取3次，每次提取1h。过滤，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，微孔滤膜(0.45μm)过滤，直接用于HPLC分析。

2)对照品溶液精密称曲一定量标准品苦杏仁苷和迷迭香酸，分别制备浓度为80μg/mL和40μg/mL的标准品溶液，使用时按比例稀释成不同浓度工作液。

3)阴性对照溶液按照供试品溶液相同制备方法制备苦杏仁、紫苏叶阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

参照已发表文献条件[8～12]，流动相为乙腈-甲酸水；色谱柱：Aglient TC-C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm) ；梯度条件为：0～30min，6%A；30～70min，27%A；70～80min，6%A；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：λ1=222nm (0～40min)，λ2=330nm (40～70min)。

2.3 系统适用性试验

图1 对照品溶液色谱

取上述制备好的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5μL，进行HPLC分析。色谱图见下图1、2、3。

2.4 线性关系

用上述标准品溶液，加甲醇制备浓度为160μg/mL的苦杏仁苷对照品工作液，并分别精密吸1、2、4、6、8mL该溶液于10mL容量瓶中，定容摇匀，分别进行HPLC分析(所有分析重复进样3次)。数据结果以色谱中峰面积平均值(Y)对苦杏仁苷进样量(X)绘制标准曲线，计算回归方程。制备迷迭香酸80μg/mL工作液，利用上述同样方法HPLC进样分析，进行线性关系考察。

图2 杏苏散水提液色谱图图3 阴性对照溶液色谱图

结果表明，苦杏仁苷在0.08～0.64μg(Y=27.390X+0.0522，r=0.9999)范围内呈良好线性关系；迷迭香酸在0.04～0.32μg(Y=26.141X+0.0905，r=0.9997)范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

采用同样HPLC分析方法，进行6次杏苏散水煎液分析(进样量为10μL)，结果RSD=0.2%，情况良好。

2.6 稳定性试验

采用同样HPLC分析方法，于0、2、4、8、12、24h测定杏苏散水提取液中苦杏仁苷和迷迭香酸的峰面积，计算RSD=0.6%，说明样品溶液在24h内稳定情况良好。

2.7 重复性试验

采用同样HPLC分析方法，对样品溶液连续进样6次分析，计算后得到的苦杏仁苷含量为0.8219mg/g(RSD=1.5%)；迷迭香酸含量为0.4211mg/g(1.5%)。

2.8 加样回收试验

取上述2.7中的样品溶液，分别精密加入一定量的苦杏仁苷和迷迭香酸对照品标准溶液，采用同样HPLC分析方法。结果见表1、表2。

表1 杏苏散水煎液中苦杏仁苷的加样回收率实验结果

表2 杏苏散水煎液中迷迭香酸的加样回收率实验结果

2.9 含量测定

按杏苏散制备工艺制备3批样品，按上述HPLC分析方法，利用外标法测定杏苏散水煎液中苦杏仁苷和迷迭香酸的含量，结果见表3。

表3 杏苏散水煎液中苦杏仁苷和迷迭香酸的含量结果

3 结论

本实验对杏苏散中苦杏仁苷和迷迭香酸的测量波长进行了考察，结果表明当波长λ1=222nm，λ2=330nm，基线平整，噪音较小。本实验所建立的双波长-HPLC法测定杏苏散中苦杏仁苷和迷迭香酸含量的分析方法简单、准确、有效。为该中药经典复方的质量控制分析方法奠定了坚实的基础。同时，该方法可为在其它中药及中药复方中测定苦杏仁苷和迷迭香酸含量的研究中提供经验借鉴。

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