保肾冲剂对系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾组织内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78表达的影响※

贾秀琴 杨继红 李映红 郭文鹏 李利民 杨 敏

(广东省深圳市第二人民医院中西医结合研究所，广东 深圳 518035)

保肾冲剂对系膜增生性肾小球肾炎大鼠肾组织内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78表达的影响※

贾秀琴 杨继红1李映红 郭文鹏2李利民 杨 敏

(广东省深圳市第二人民医院中西医结合研究所，广东 深圳 518035)

目的 观察保肾冲剂对系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)大鼠肾脏的保护作用及内质网应激(ERS)相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响，探讨其作用机制。方法 将21只雄性SD大鼠随机分为造模组(14只)及空白对照组(7只)。造模组大鼠予尾静脉注射抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)建立MsPGN模型，造模成功后再随机分为模型组及中药组，每组7只。中药组给予保肾冲剂药液灌胃，空白对照组和模型组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，连续14周。实验结束后，观察比较各组大鼠治疗前后24 h尿蛋白定量(24 h UTP)及血肌酐(Cr)水平变化，并检测大鼠肾组织内GRP78蛋白及基因表达水平情况。结果 治疗前中药组及模型组大鼠24 h UTP及Cr水平均明显高于空白对照组(P<0.05)，治疗后中药组大鼠24 h UTP及Cr水平较模型组均明显降低(P<0.05)；模型组及中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均明显高于空白对照组(P<0.05)，但中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均低于模型组(P<0.05)。结论 MsPGN大鼠肾脏组织GRP78表达增高，提示ERS可能参与其肾脏损害过程，而中药保肾冲剂对MsPGN模型大鼠肾脏具有一定的保护作用，可减轻大鼠肾功能损害，降低大鼠24 h UTP及Cr水平，降低GRP78蛋白及基因表达水平，从而起到治疗作用，且抑制ERS相关蛋白GRP78的过度表达可能是其减轻肾功能损害的重要作用机制靶点之一。

肾小球肾炎，膜增生性；动物，实验；大鼠；中药疗法

系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是原发性肾小球疾病中最常见的肾小球病变，是我国相关患者导致终末期肾病的主要原因之一，因此对MsPGN的研究倍受关注[1-3]。目前，MsPGN的发病机制尚不完全明确，近年来越来越多的研究证实，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在许多疾病的发生发展过程中具有重要作用，过强或者过长时间的ERS都可引起细胞凋亡[4-6]，而肾脏细胞中具有发达的内质网，慢性肾炎状态下ERS激活的刺激因素大大增加，所以ERS与慢性肾炎肾损害的关系值得探讨[7]。本研究拟通过建立大鼠MsPGN模型，观察中药保肾冲剂对MsPGN模型大鼠的治疗作用，并通过测定大鼠24 h尿蛋白定量(24h UTP)、血肌酐(Cr)及ERS标志分子——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)[8]水平变化，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 2个月龄清洁级SD雄性大鼠21只，体质量(200±10)g，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。实验期间自由饮水，室温20～24 ℃，相对湿度40～50%。

1.2 药物 保肾冲剂由生地黄、山药、山茱萸、泽泻、党参、黄芪、丹参、白花蛇舌草、黄柏、茯苓、益母草及甘草等药物组成，所有中药材均购自广东省深圳市北京同仁堂药店，常规水煎，浓缩成含原药材1.962 g/mL，4 ℃冷藏保存备用。抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)的制备：取4～6周龄大鼠胸腺细胞，纯化为单胸腺细胞，调整细胞水平至5×107/L，成为单胸腺细胞悬液，与完全福氏佐剂做1∶2体积混合，按每只5×107/L个细胞量将胸腺细胞多点皮下注射免疫新西兰兔，然后每隔2周按每只家兔1×107/L细胞经耳静脉直接注射加强免疫，共加强免疫3次，末次免疫1周后，间接免疫荧光测ATS的效价结果为1∶2 000时，表明ATS制备成功。第7周采血，4 ℃冷藏析出血清，并经大鼠新鲜红细胞及肝细胞吸附，分装后于-20 ℃保存，使用时56 ℃水浴30 min灭活补体。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂 尿蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所提供；GRP78抗体，武汉维诺赛生物技术有限公司提供。

1.3.2 仪器 微型高速离心机，美国Labnet公司；电热恒温培养箱，日本ASONE株式会社；全自动酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；RM 2016轮转式切片机，德国Leica公司；BX53型生物显微镜，日本奥林巴斯株式会社；ABI7900型实时荧光定量PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 造模 全部大鼠购回后适应性喂养1周，并检测尿蛋白定性(-)后，随机分为造模组(14只)及空白对照组(7只)。造模组大鼠予尾静脉注射ATS 1 mL/100 g，1周1次，共注射4次。注射结束1 d后查大鼠尿蛋白，如尿蛋白(+++)即可判定为模型成功。空白对照组大鼠正常饲养。

1.4.2 分组及给药 将14只造模组大鼠随机分为中药组及模型组，各7只。中药组给予保肾冲剂药液灌胃2 mL/只，每日1次，连用14周。空白对照组及模型组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，每日1次，连用14周。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 肾脏病理检查 各组大鼠均在实验第14周末采集留取血液标本后，用3%戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔内注射麻醉后处死，并迅速切取左肾，去掉被膜，置于质量分数0.04多聚甲醛固定，进行苏木精-伊红(HE)法染色，并在光镜下观察肾脏形态学改变。

1.5.2 24 h UTP及Cr检测 各组大鼠造模治疗前1 d及造模治疗14周后收集24 h尿液，进行24 h UTP测定。在造模治疗前1 d及造模治疗14周后经股动脉取血，采用全自动生化分析仪检测血Cr水平变化。

1.5.3 GRP78蛋白表达 采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)观察各组大鼠肾组织GRP78蛋白表达水平。取大鼠肾组织碎块80 mg加400 μL单去污剂裂解液于匀浆器中匀浆，置冰上，重复碾至尽量碎，裂解30 min后，将裂解液移至1.5 mL离心管中，4 ℃以12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20 ℃保存。将制备好的蛋白样品加入5%及10%凝胶中电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤缓冲液洗膜(5 min×6次)，加入二抗(1∶50 000)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗涤缓冲液洗膜(5 min×6次)，电化学发光(ECL)显影。蛋白条带采用Bandscan软件进行分析，将GRP78 的积分光密度(IOD)值与所对应样品的β-actin IOD值进行比较，分析GRP78蛋白表达水平。

1.5.4 GRP78基因表达 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察各组大鼠肾脏GRP78基因表达水平。取-80 ℃冰箱中保存的新鲜冰冻肾组织，加入1 mL总RNA抽提试剂(Trizo)，用匀浆器研磨成浆，移至无核糖核酸酶(RNase)的1.5 mL EP管中，裂解10 min。加入200 μL氯仿，混匀后室温放置5 min。4 ℃以12 000 r/min离心15 min。转移上层水相(约400 μL)于另一新1.5 mL EP管中，加入400 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min。离心后弃上清，加入无RNase的75%乙醇1 mL，混匀后再离心。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min后溶于20 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。将总RNA放于-80 ℃冰箱内保存以备用。以提取的RNA为模板合成cDNA，反应体系：总RNA 2.322 μg，Oligo (dT) 15(10 μM) 2 μL，以DEPC水补足容积到8.5 μL，85 ℃水浴5 min，置于冰上。加入5×Hiscript Buffer 4 μL，2.5 mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL，Hiscript逆转录酶1 μL，核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor) 0.5 μL，总体积为20 μL，25 ℃水浴5 min，50 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 min后置于冰上10 min，-20 ℃保存备用。引物合成委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。GRP78 (195 bp)包括正义链5'-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3'和反义链5'-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3'，β-actin (240bp)包括正义链5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'和反义链5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系见表1。蛋白表达条带采用Bandscan软件进行分析，将GRP78 mRNA的IOD值分别与所对应样品的β-actin的IOD值进行比较，分析其表达水平。

表1 RT-PCR反应体系

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗后肾组织GRP78蛋白及基因表达水平IOD值比较 见表2。

表2 各组大鼠治疗后肾组织GRP78蛋白

与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

由表2可见，模型组及中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均高于空白对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)；中药组大鼠治疗后GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均低于模型组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠治疗后肾脏形态学比较 模型组大鼠肾小球弥漫肥大，肾小球内系膜细胞和基质增多，基底膜增厚，肾小球囊腔狭窄，可见有包氏囊粘连，肾小管上皮细胞肿胀，部分肾小管萎缩或扩张，部分肾小管腔内可见粉染无结构物，部分肾小管上皮细胞基底膜增厚，肾间质有炎性细胞浸润，小叶间动脉管壁轻度增厚。中药组大鼠部分肾小球肥大，肾小球内系膜细胞和基质轻度增多，基底膜轻度增厚，部分肾小球囊腔轻度狭窄，部分肾小管上皮细胞基底膜轻度增厚，肾间质小灶状炎性细胞浸润，小血管未见明显异常。空白对照组大鼠肾组织结构无异常。表明模型组大鼠肾组织发生明显病理损害，中药组大鼠肾脏病理损害有一定程度减轻，见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理组织检查结果(HE×200)

2.3 各组大鼠治疗前后24 h UTP 及Cr水平变化比较 见表3。

表3 各组大鼠治疗前后24 h UTP 及Cr水平变化比较

组 别n24hUTP(mg/L)治疗前治疗后Cr(μmol/L)治疗前治疗后模型组74982.019±840.722*4153.453±400.76185.786±6.394*81.043±6.111中药组74875.792±998.458*1946.978±455.494△87.386±6.177*38.386±6.700△空白对照组71110.825±201.584958.314±183.14129.714±3.50228.567±11.174

与空白对照组治疗前比较，*P<0.05；与模型组治疗后比较，△P<0.05

由表3可见，治疗前，中药组及模型组大鼠24 h UTP及Cr水平均高于空白对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗后，中药组大鼠24 h UTP及Cr水平均低于模型组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

MsPGN病变可导致肾小球硬化并最终出现肾衰竭，严重影响患者健康，并产生高额的医疗费用，目前对其发病机制的认识尚不完全，近年来越来越多的研究证实，ERS在其发生发展中发挥着重要作用[9]。ERS作为机体自身的一种内源性保护防御机制，是细胞对外界刺激因素的适应性反应，在维持细胞生存或细胞凋亡平衡中具有重要作用,一定程度的内质网应激反应可以激活内质网分子伴侣等保护因子的表达，保护细胞抵抗应激[10]。但是反应过强或持续时间过长即可引起细胞功能失调，甚至细胞死亡等病理现象，故ERS具有重要的生理及病理意义。肾脏细胞具有发达的内质网，从肾脏细胞的结构和功能分析，肾脏具有发生ERS的条件和基础。目前关于ERS与慢性肾炎肾损害的具体实验证据尚不充分,针对ERS及其信号传导通路在肾脏疾病发病中的作用进行研究，可能为寻找肾脏疾病新的防治靶点提供新思路和新方向[11]。

GRP78是内质网一种特异的分子伴侣，属于热休克蛋白70家族，是内质网稳态的感受器，在检测内质网中未折叠蛋白质的聚集和ERS的激活过程中发挥重要作用。GRP78在应激状态下可通过解离调节ERS相关跨膜信号感受器活性，被广泛认为是ERS激活的标志分子[12]，GRP78表达异常可明显加重ERS引起的细胞损伤[13]，高血糖、蛋白尿等引起的肾实质细胞凋亡中均有ESR的参与[14]。本实验结果显示，与空白对照组比较，模型组GRP78蛋白及基因表达水平IOD值均明显升高(P<0.05)，病理观察结果也显示模型组大鼠肾脏呈现肾小球弥漫肥大，肾小球内系膜细胞和基质增多，基底膜增厚，肾小球囊腔狭窄，可见有包氏囊粘连，肾小管上皮细胞肿胀，肾间质有炎性细胞浸润，小叶间动脉管壁轻度增厚，可以判断模型组出现了MsPGN的病理改变。

MsPGN属中医学腰痛、水肿等范畴，本病病情表现复杂，病程冗长，其病机特点多为本虚标实，虚实夹杂。本虚表现以脾肾气阴两虚、肾络空虚为主，标实主要表现为湿热、瘀血、浊毒郁滞肾络，正虚与邪实互为因果相互影响[15]。保肾冲剂正是针对本病肾络空虚、瘀浊阻滞病机，采用六味地黄汤加减而成。方中生地黄、山茱萸滋补肝肾；党参、黄芪、茯苓、泽泻补益脾肾，利水消肿；山药补脾涩精固肾；白花蛇舌草解毒化浊；丹参活血化瘀；黄柏滋阴清热燥湿；益母草活血利水；甘草和中解毒。诸药合用，共奏益气养阴、活血祛浊通络之功[16]。本实验结果显示，与模型组比较，中药组肾组织病理变化明显轻于模型组，中药组治疗后24 h UTP及Cr水平均低于模型组(P<0.05)，GRP78蛋白及基因表达水平也明显低于模型组(P<0.05)。

本研究结果表明，MsPGN大鼠肾脏组织GRP78表达增高，提示ERS可能参与其肾脏损害过程，而中药保肾冲剂对MsPGN模型大鼠肾脏具有一定的保护作用，可减轻大鼠肾功能损害，降低大鼠24 h UTP及Cr水平，降低GRP78蛋白及基因表达水平，从而起到治疗作用，且抑制ERS相关蛋白GRP78的过度表达可能是其减轻肾功能损害的重要作用机制靶点之一。

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(本文编辑：石 康)

Effects of Protect-kidney granules on the expression of ERS-related glucose regulation protein-78 in kidney of mesangial proliferative glomerulonephritis rats

JIAXiuqin*,YANGJihong,LIYinghong,etal.

*InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SecondPeople'sHospitalinShenzhenCity,Guangdong,Shenzhen518035

Objective To observe the effects of Protect-renal granules on the protection of kidney in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN)and the expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) related glucose regulation protein-78 (GRP78), and to explore its action mechanism. Methods 21 male SD rats were randomly divided into modeling group (n=14) and blank control group (n=7). MsPGN models were established by the tail vein injection of anti-rat thymocyte serum(ATS)in modeling group. Rats with successful modeling were randomly divided into model group and traditional Chinese medicine(TCM) group, 7 rats in each group. The TCM group received Protect-kidney granules by gavage, the blank and model group were received 0.9% sodium chloride injection by gavage at the same volume, continuously taking for 14 weeks. After the experiment, the changes of the 24 hour urine protein quantification(24h UTP)and serum creatinine(Cr)before and after treatment were observed in each group. The expressions of protein and genes of GRP78 in rats' kidney were measured. Results The levels of 24h UTP and Cr before treatment in TCM and model group were obviously higher than blank control group (P<0.05). The levels of 24 h UTP and Cr after treatment in TCM group were significantly lower than model group (P<0.05). The immediate oxygen demand (IOD) of protein and gene expressions of GRP78 after treatment in model and TCM group were obviously higher than blank control group (P<0.05), but the IOD after treatment in TCM group was obviously lower than model (P<0.05).Conclusion The increased expression of GRP78 in MsPGN rats'kidney tissue indicate that ESR may participate in the pathogenesis of kidney damage, while the Protect-renal granules has certain protection of MsPGN, can reduce kidney damage, decrease the levels of 24 h UTP and Cr, and down-regulated expression of protein and gene of GRP78, thus play a therapeutic role, and to suppress the overexpression of ERS-related protein GRP78 may be one of the target spot of kidney renal damage.

Glomerulonephritis; Membrane proliferative; Animals; Experiment; Rats; Traditional Chinese medicine therapy

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.01.027

※ 项目来源：深圳市科技创新委员会2014年市科技研发资金知识创新计划(编号：JCYJ20140414170821241)

贾秀琴(1962—)，女，主任医师，学士。从事中西医结合肾脏病临床及基础研究。

R285.5；R692.31

A

1002-2619(2017)01-0104-05

2016-11-22)

1 广东省深圳市第二人民医院儿科，广东 深圳 518035

2 广东省深圳市第二人民医院中心实验室，广东 深圳 518035