NF-κB和HBD-2的表达情况与宫腔粘连的相关性分析

姚雅俪 邓曼丹 李毅

·论著·

NF-κB和HBD-2的表达情况与宫腔粘连的相关性分析

姚雅俪 邓曼丹 李毅

目的 探讨核因子κB(NF-κB)和β-防御素2(HBD-2)表达与宫腔粘连的关系。方法 选取治疗的51例宫腔粘连患者的子宫内膜作为观察组，同时选取42例正常内膜组织作为对照组，采用免疫组织化学检测2组NF-κB和HBD-2表达水平，RT-PCR检测NF-κB mRNA和HBD-2 mRNA表达。结果 NF-κB在观察组中的高表达比例为80.39%明显高于对照组的11.90%，差异有统计学意义(P<0.05)；HBD-2在观察组中的高表达比例为94.12%，明显高于对照组的16.67%，差异有统计学意义(P<0.05)；不同程度宫腔粘连患者NF-κB和HBD-2高表达差异无统计学意义(P>0.05)；观察组NF-κBmRNA与HBD-2mRNA相对表达量分别为(9.56±2.27)和(9.60±2.31)，明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论NF-κB和HBD-2在宫腔粘连内膜组织中呈高表达，两者可能与宫腔粘连的发生发展有关。

宫腔粘连；NF-κB；HBD-2；内膜组织

妇产科各种手术均可以导致子宫内膜的损伤，进而促进宫腔粘连的发生，相关研究表明人工流产术后、引产以及诊断性刮宫术后的宫腔粘连的发生率分别达1.5%、1.6%、1.9%[1,2]，且由于各种妇产科宫腔操作手术量的增加，宫腔粘连的发生率呈现明显上升的趋势[3]。研究表明，纤维细胞释放的纤维蛋白原以及纤维蛋白溶解酶原在调控子宫内膜局部细胞外基质中具有重要的作用，调节平衡的丧失可以导致细胞外基质的过度堆积，子宫内膜逐步被纤维结缔组织取代，最终促进了宫腔粘连的发生[4,5]。核因子NF-κB(nuclear factor κB，NF-κB)和防御素2(βdefensin 2，HBD-2)可以通过激活成纤维细胞膜上的生长因子转化受体，促进组织型金属蛋白酶抑制因子的合成和释放，导致细胞外基质代谢紊乱和沉积不良，促进宫腔粘连的发生。本次研究重在通过免疫组化分析NF-κB和HBD-2蛋白水平以及RT-PCR技术检测mRNA的表达，进而评估二者在宫腔粘连发生发展中的作用，从而为宫腔粘连的生物学治疗提供新的选择。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年1月在我院治疗的51例宫腔粘连患者的子宫内膜作为观察组，年龄24～35岁，平均年龄(30.32±2.31)岁；同时选取因继发性不孕行宫腔镜检查的42例患者的正常内膜组织作为对照组；纳入标准：(1)患者经宫腔镜检查证实；(2)入选前6个月未使用过任何激素制剂；(3)无子宫内膜良恶性及癌前病变、妇科内分泌疾病、乳腺肿瘤及乳腺增生；(4)患者知情同意并签署同意书。排除标准：(1)有生殖道急性炎症；(2)子宫内膜不典型增生，有宫内节育器及过敏史；(3)有全身结缔组织病变，心、肝、肾等重要脏器疾病。

1.2 检测方法 (1)免疫组化检测NF-κB和HBD-2的表达采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室温孵育5 min，采用去离子水水冲洗3次，每次3 min，采用浓度为10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 ml纯水)封闭，室温孵育5 min，加入NF-κB和HBD-2抗体(鼠来源，南京碧云天生物科技有限公司),37 ℃孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，滴加HRP标记的二抗(兔来源，购自罗氏检测公司)，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，加入 NBT/BCIP色剂显色5 min，复染，脱水，透明，封片，镜下观察。OLIPICS电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。(2)采用RT-PCR技术检测 mRNA的表达采集患者静脉血2 ml，按照10 000 r/min的离心速度进行离心分离血清，每1毫升的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，加0.2 ml氯仿，剧烈摇动30 s，室温3 min，12 000×g，4℃离心15 min得到RNA。加等体积异丙醇，-20℃，30 min，弃上清，加75%乙醇1 ml，振荡，20 μl DEPC水，室温放置5分钟使其完全溶解。加入逆转录酶5 μl，室温下放置20 min后植入37℃水浴锅中孵育30 min，在底物中加入上游引物0.5 μmol/L、下游引物0.5 μmol/L，RT-PCR反应混合液5 μl，dNTP稀释至 20 μl，反应条件：95℃3 min、95℃15 s、90℃5 s，一共40个循环，产物扩增长度为134 bp。

1.3 诊断标准 宫腔粘连分度标准采用1988年美国生育协会(AFS)制定的分级标准[6]，对宫腔粘连面积、病理性质及月经量进行评分，轻度：1～4分；中度：5～8分；重度：9～12分。

1.4 结果判断 以境界清晰的棕黄色或棕褐色颗粒状沉淀为阳性表达。每张切片随机选取4个高倍下计数，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞比例，根据染色强度和阳性细胞比例结果进行判断。阳性细胞比例评分：0分为≤10%，1分为11%～25%，2分为26%～50%，3分为>50%；染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。两者乘积进行判断，0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～6分为阳性(++)，>6分为强阳性(+++)，其中阳性和强阳性为高表达。

2 结果

2.1 2组NF-κB的表达NF-κB在观察组中的高表达为80.39%。明显高于对照组的11.90%，2组NF-κB表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组NF-κB的表达 例(%)

2.2NF-κB在轻、中、重度宫腔粘连患者中的表达 不同程度宫腔粘连患者NF-κB高表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 NF-κB在轻、中、重度宫腔粘连患者中的表达 例(%)

2.3 2组HBD-2在的表达HBD-2在观察组中的高表达比例为94.12%，明显高于对照组的16.67%，2组HBD-2表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4HBD-2在轻、中、重度宫腔粘连患者中的表达 不同程度宫腔粘连患者NF-κB高表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 2组HBD-2的表达 例(%)

表4 HBD-2在轻、中、重度宫腔粘连患者中的表达 例(%)

2.5NF-κBmRNA与HBD-2mRNA在2组中的表达 观察组NF-κBmRNA与HBD-2mRNA相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

宫腔粘连一般是指宫颈管、宫腔内膜部位因为宫腔手术的机械系损伤或者射线以及感染等因素，导致的子宫腔的相互粘连。近年来对于宫腔粘连的研究多数聚焦于其临床治疗方面的效果，包括宫腔镜联合雌孕激素复合药物等治疗宫腔粘连仍然具有一定的局限性。通过对于粘连发生基质以及相关细胞生物学因子方面的探讨，能够为揭示粘连的发生机制以及分子生物学治疗提供新的靶点，改善其临床治疗的效果。成纤维细胞多数由于间充质细胞分化而来，具明显的蛋白质合成和分泌活动，可以实现低聚状态的纤维成分转化为多聚状态的细胞间质成分[7,8]，并可在细胞损伤、组织修复等病理过程中通过分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质进而调节细胞外基质的稳定代谢[9,10]。

表5 2组NF-κBmRNA与HBD-2mRNA比较

组别NF-κBmRNA相对表达量HBD-2mRNA相对表达量对照组(n=42)1.04±0.301.01±0.21观察组(n=51)9.56±2.279.60±2.31t值-24.128-23.995P值<0.05<0.05

任何可以影响到成纤维细胞生物学活性或者功能状态的因子，都可以促进结缔组织的过度增生，促进粘连的发生。NF-κB是高度保守的细胞因子，在哺乳动物的体细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等细胞膜上具有不同数量的NF-κB受体的表达，NF-κB通过与成纤维细胞膜上的转化生长因子受体结合，进一步上调细胞内的环磷酸腺苷、钙离子等第二信使后，调控细胞炎性因子的转录并影响到成纤维细胞的活性[7,11]。HBD-2作为天然的抗内毒素以及多种微生物的内源性多肽，在抗炎过程中发挥了重要的作用，同时HBD-2可以影响到MAPK、NF-κB等信号通路的激活，起到促进NF-κB信号通路下游效应分子的表达、增强NF-kB激活的生物学效果，并能够协同刺激成纤维细胞的转化生长因子受体。相关研究已证实，NF-κB以及HBD-2与宫腔粘连具有一定的关联，并与宫腔镜治疗的临床转归有关[12,13]，但对于二者的免疫组化以及基因水平的探讨不足，此为本次研究的创新性所在。

本研究发现NF-κB在观察组中的高表达比例为80.39%，明显高于正常对照宫腔内膜组织，其中在宫腔粘连组织中，NF-κB的阳性以及强阳性率占到了主要部位，均超过了20%，而弱阳性比例较低，表明NF-κB在宫腔粘连的发生发展过程中可能具有一定的促进作用。NF-κB通过各种途径以及信号通路效应进而促进金属蛋白类酶原的产生减少，抑制其生理性活动能力，从而使得细胞外基质的讲解减少、宫腔粘连的发生率增加。但本次研究中并未发现NF-κB在不同严重程度的宫腔粘连中的表达差异，考虑NF-κB主要在粘连的发生早期起到一定的生物学效应，同时可能与本次研究的样本量不足有关。HBD-2可增强丝氨酸残基磷酸化效应，促进NF-κB与NF-κB成纤维细胞膜上的相关受体的结合能力，增强胶原纤维以及疤痕组织的形成能力，HBD-2在观察组中的高表达比例为94.12%，明显高于正常对照组，且多数为阳性以及强阳性的表达，提示HBD-2在宫腔粘连的发生发展过程中可能同样发挥了重要的调控作用。

Zhang等[14,15]通过分析宫腔镜局部切除术后的宫腔粘连患者的相关蛋白水平的表达分析可见，NF-κB在粘连组织中的表达阳性率可上升4～5倍，其机制可能与促进成纤维细胞表面的金属蛋白酶转录调节因子受体有关，同时NF-κB的阳性率与宫腔镜治疗后的粘连复发率具有一定的关联。对于mRNA转录水平的研究可见，观察组NF-BmRNA与HBD-2mRNA相对表达量均明显上升，提示在基因转录水平即可发生NF-κB以及HBD-2的表达的差异，NF-κB以及HBD-2转录上游的启动子以及增强子的激活，可以促进NF-κB以及HBD-2蛋白水平的表达，但具体的转录调节机制仍然需要进一步探讨。

综上所述，NF-κB和HBD-2在宫腔粘连内膜组织中呈高表达，同时在mRNA水平也可见二者的异常表达，NF-κB和HBD-2在宫腔粘连的发生发展过程中可能发挥了重要的调节作用，但具体的机制研究仍然有待后续大规模、多种心的对照研究。

1 吴琼蔚，谢晖亮，马成斌，等.宫腔粘连767例临床分析.实用妇产科杂志,2014,24:354-357.

2 付熙，林琳，万晓慧.宫腔镜联合超声监视在宫腔中、重度粘连电切手术中的应用价值.中国妇幼保健,2014,43:5922-5924.

3 贺斯黎，肖松舒，邓新粮，等.重度宫腔粘连危险因素分析.中华妇产科杂志,2015,50:54-56.

4 高红艳，陈继明，刘芳，等.TGF-β1对小鼠子宫内膜基质细胞MMP-9表达的影响.重庆医学,2015,42:5054-5056.

5 黄燕明，王燕，郎雁，等.宫腔粘连综合治疗218例预后分析.中国实用妇科与产科杂志,2015,25:1025-1028.

6EfetieER,UmezulikeAC,OkaforUV.Clinicalanddemographiccharacteristicsofwomenwithintrauterineadhesioninabuja,Nigeria.ObstetGynecolInt,2012,20:435-441.

7 徐洁，刘艳，郭遂群.雌激素受体及基质金属蛋白酶-9在宫腔粘连组织中的表达及意义.广东医学,2015,24:1222-1225.

8 任娟，卫兵，宋恩学，等.生长激素受体在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义.安徽医科大学学报,2015,42:1004-1007.

9SalmaU,XueM,SheikhM,etal.RoleofTransformingGrowthFactor-β1andSmadsSignalingPathwayinIntrauterineAdhesion.MediatorsofInflammation,2016,28:90-92.

10 高红艳，刘芳，谢军，等.TGF-β_1及MMP-9在宫腔粘连内膜组织中的表达与意义.中国妇幼保健,2014,32:3971-3974.

11 曾薇薇，姚吉龙，史文娟，等.氧化再生纤维素防粘连膜在重度宫腔粘连治疗中的作用及其对转化生长因子β1表达的影响.现代妇产科进展,2016,25:22-24.

12KimT,AhnKH,ChoiDS,etal.Arandomized,multi-center,clinicaltrialtoassesstheefficacyandsafetyofalginatecarboxymethylcellulosehyaluronicacidcomparedtocarboxymethylcellulosehyaluronicacidtopreventpostoperativeintrauterineadhesion.JMinimInvasiveGynecol,2012,19:731-736.

13ChenY,ChangY,YaoS.Roleofangiogenesisinendometrialrepairofpatientswithsevereintrauterineadhesion.IntJClinExpPathol,2013,6:1343-1350.

14ZhangJ,ZhuL,HuangX,etal.MitochondrialDNAHaplogroupRConfersaGeneticRiskFactorforIntrauterineAdhesioninHanWomenPopulation.GynecolObstetInvest,2015,32:102-105.

15 周曼萍，何援利，乔琳，等.转化生长因子-β_1及Smad2/3在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义.广东医学,2014,24:1844-1847.

Expression of NF-κB and HBD-2 in endometrium of patients with intrauterine adhesion

YAOYali,DENGMandan,LIYi.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,TheFirstHospitalofChangshaCity,Changsha410005,China

Objective To investigate the correlation between the expressions of nuclear factor B (NF-κB),βdefensin 2 (HBD-2) and intrauterine adhesion.Methods Fifty-one patients with intrauterine adhesion who were treated in our hospital from January 2015 to January 2016 were served as observation group,at the same time,42 healthy subjects with normal endometrial tissues were served as control group.The expression levels of NF-κB mRNA and HBD-2 mRNA were detected by RT-PCR.Results The high-expression proportion of NF-κB in observation group was 80.39%,which was significantly higher than that (11.90%) in control group (P<0.05),moreover,thehigh-expressionproportionofHBD-2inobservationgroupwas94.12%,whichwassignificantlyhigherthanthat(16.67%)incontrolgroup(P<0.05).Howevertherewasnosignificantdifferenceinthehigh-expressionproportionofNF-κBandHBD-2inpatientswithintrauterineadhesionatdifferentdegrees(P<0.05) 5).TherelativeexpressionlevelsofNF-κBmRNAandHBD-2mRNAinobservationgroupwere9.56±2.27and9.60±2.31,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).Conclusion The high-expressions of NF-κB and HBD-2 exist in endometrium of patients with intrauterine adhesion,and both factors may be correlated to the pathogenesis and development of intrauterine adhesion.

intrauterine adhesions; NF-κB;HBD-2;endometrial tissues

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.009

410005 湖南省长沙市第一医院妇产科

R

A

1002-7386(2017)06-0837-04

2016-09-18)