杜洛克×陆川猪杂交F1代MC1R基因型分析

秦 珂，曾检华，薛 明，宋德清，杨红杰，何祖勇，刘小红

（1．中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东 广州 510006；2．广东壹号食品股份有限公司，广东 广州 510620；3．全国畜牧总站，北京 100125）

杜洛克×陆川猪杂交F1代MC1R基因型分析

秦 珂1，曾检华2，薛 明3，宋德清2，杨红杰3，何祖勇1，刘小红1

（1．中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东 广州 510006；2．广东壹号食品股份有限公司，广东 广州 510620；3．全国畜牧总站，北京 100125）

为了解释杜洛克和陆川猪杂交F1代毛色分离现象，以5窝黑毛全同胞杜陆仔猪及其母本为对照，利用PCR测序法对4窝毛色异常全同胞杜陆仔猪及其母本的MC1R基因型进行分析。结果表明，5窝黑毛全同胞杜陆仔猪MC1R基因型均为ED1/e，母本MC1R基因型均为ED1/ ED1；4窝毛色异常全同胞杜陆仔猪中，黑毛杜陆猪MC1R基因型均为ED1/e，红毛杜陆猪MC1R基因型均为e/e，母本MC1R基因型均为ED1/e。由于纯种杜洛克MC1R基因型为e/e，纯种陆川猪MC1R基因型为ED1/ ED1，理论上其杂交F1代杜陆猪MC1R基因型应该为ED1/e，毛色表现为黑色。研究结果显示，产毛色分离仔猪的母本为杂合子，含有杜洛克血统，因此，杂合子母猪和杜洛克杂交产生MC1R基因型表现为纯种杜洛克所特有的e/e，子代表现为红毛，从分子水平揭示了杜陆猪毛色分离的原因。以MC1R基因为分子标记可以指导猪场快速淘汰杂合子陆川猪母本，迅速纯化基础群。

杜洛克；陆川猪；杜陆猪；毛色分离；MC1R基因

在动物育种工作中，毛色作为动物最直观的一个表型性状，同时也是一种可利用的遗传标记，可以帮助确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系等。猪的毛色表型丰富多样，可分为野灰色、全黑、全红、全白、多米诺黑点、黑红斑块、黑底白点等类型。控制毛色的基因较为复杂，目前在哺乳动物中已发现378个与毛色相关的遗传位点和171个毛色相关基因［1］，如黑素皮质素受体1基因（Melanocortin receptor 1 gene，MC1R）［2］、v-kit猫科肉瘤病毒转化基因（v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog，KIT）［3］、内皮素受体B基因（Endothelin receptor B gene，EDNRB）［3］和小眼畸形相关转绿因子基因（Microphthalmiaassociated transcription factor，MITF）［4］等，涉及到黑色素细胞前体物的生长、存活、迁移、分化以及色素的合成等重要生理、生化过程［5］。

黑皮质素受体1（MC1R），也称为黑素细胞刺激激素受体（MSHR），属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族成员，是参与调节哺乳动物皮肤和毛发颜色的关键蛋白质之一。它在表皮和毛囊的黑色素细胞中表达。MC1R通过与其配体促进剂α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）或拮抗剂刺鼠蛋白（Agouti）的竞争性结合分别形成真黑素和褐黑素，从而影响猪的毛色表型［6］。Gustafsson等［7］根据前人的研究，对9个猪种的MC1R基因定义了5种基因型E+、ED1、ED2、Ep、e（显性顺序为ED1/ED2＞E+＞Ep＞e），其中，E+对应野猪的野灰色表型、ED1对应欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑色表型、ED2对应汉普夏的黑毛色表型、Ep对应皮特兰的斑块表型、e对应杜洛克的红毛色表型。Fang等［8］根据5种MC1R基因型总结了13种单倍型，其中基因型E+、ED1、ED2、Ep、e分别对应5、3、1、3、1种单倍型。Evagelia等［9］和Klomtong［10］等提出根据MC1R基因型在不同猪种间的差异性，可作为鉴定猪种的分子标记。Linderholm等［11］利用线粒体DNA多态性，并结合MC1R基因124密码子第1个碱基G＞A错义突变，鉴定出夏威夷猪具有欧洲猪血统。本实验室最近研究表明，5个华南地方猪种（陆川猪、大花白猪、巴马香猪、粤东黑猪、莆田黑猪）MC1R基因型均为ED1/ED1，存在两个特殊碱基突变（283G＞A、305T＞C），导致两个氨基酸的错义突变（Val＞Met、Leu＞Pro），明显区别于外国猪种如大白猪、长白猪、皮特兰、杜洛克等。因此，MC1R基因可以作为一种有效的分子标记鉴定陆川猪群体的纯度。

在实际养猪生产过程中，杜洛克和陆川猪杂交F1代杜陆猪毛色一般表现为全黑色。而在规模化商业养殖的情况下，有少量F1代杜陆猪毛色表现为类似于杜洛克的红毛，存在一定比例毛色分离个体，严重影响商品猪的一致性和经济性。因此，本研究通过鉴定杜陆猪及其母本的MC1R基因型，旨在从分子水平揭示杜陆猪毛色分离的原因，以期指导猪场快速淘汰杂合子陆川猪母本，迅速纯化基础群。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 供试猪只共59头，其中杜洛克父本3头、陆川猪母本9头、杜陆仔猪47头（包括5窝毛色正常全同胞杜陆仔猪和母本、4窝毛色分离全同胞杜陆仔猪和母本），均来源于广东壹号食品股份有限公司。采集的样本均为猪耳组织，现场取样后经生理盐水洗净，置于75%乙醇中，尽快送达实验室，直接提取基因组或保存于-80℃备用。

1.1.2 主要试剂 基因组提取试剂盒Qiagen Dneasy Blood&Tissue Kit，购于广州昂科生物科技有限公司；Genstar 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，购于北京康润诚业生物科技有限公司；东盛DS2000 marker，购于广州东盛生物科技有限公司；SYBR-Green I核酸染料，购于北京普博欣生物科技有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组提取 采用基因组提取试剂盒Qiagen Dneasy Blood&Tissue Kit抽提DNA样品，并使用分光光度计测定DNA样品浓度和纯度，稀释样品浓度至100～200 ng/μL，然后存放于-20℃备用。

1.2.2 引物设计 参考GenBank已公布MC1R基因序列（登录号：AY365250.1），使用Primer primer 5软件设计MC1R基因检测引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为MC1R-F：TGTCATGGACGTGCTCATCTG，MC1R-R：GGTCCACGATGGAGTTGCAG，预期扩增片段大小为530 bp。

1.2.3 PCR反应 PCR反应体系为50 μL：模板DNA 1 μL（100～200 ng/μL），上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），PCR Mix 25 μL，补充ddH2O 22 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸40 s，36个循环；72℃后延伸10 min。PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶进行检测，4℃保存或直接送测序。

1.2.4 PCR产物测序和序列分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测合格后，送到广州艾基生物技术有限公司进行纯化和测序；测序结果使用Vector NTI 11.5.1软件进行序列比对，检测遗传变异位点；使用Chromas 2.22软件查看测序结果峰图，最终确认突变碱基类型。

2 结果与分析

2.1 毛色表型分析

纯种杜洛克原产于美国东部的新泽西州和纽约州等地，毛色表现为红色和白色两种，本试验样本为红色雄性杜洛克；纯种陆川猪产于华南地区，皮肤颜色呈一致性的黑白花，头、耳、背、腰、臀及尾为黑色，其余部位为白色，在黑白交界处有一条约4～5 cm白毛黑皮的“晕”，本试验所选择母本毛色表型均符合纯种陆川猪特征；正常杜陆猪表型应表现为全身黑色，本试验选择9窝杜陆猪仔猪，其中5窝为全黑色，4窝存在黑色和红色毛色分离现象（图1，彩插一）。

2.2 PCR扩增结果分析

利用引物MC1R-F、MC1R-R对样本MC1R基因进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果（图2）显示，PCR产物电泳条带出现微弱杂带，其中主带大小与预期目的片段大小530 bp一致，符合预期结果，可以经胶回收后用于DNA测序。

图2 MC1R基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 测序结果分析

2.3.1 序列比对 相对于海南野猪，杜洛克MC1R基因在第164、243密码子存在两个独特的错义突变451C＞T、727G＞A，引起两个氨基酸的变化，陆川猪在第243密码子存在无义突变729G＞A，这种突变目前仅在中国地方猪种中发现。因此，本试验通过检测这3个SNP，用以鉴定陆川猪母本的纯度和分析杜陆仔猪毛色分离的原因。测序结果使用Vector Nti进行序列比对，以纯种杜洛克和陆川猪MC1R基因序列为对照，发现母本1、2、3、4、5为纯合陆川猪，其黑毛仔猪在碱基451C＞T、727G＞A、729G＞A处存在突变，碱基序列表现为不同的单倍型，表现为杂合子；母本6、7、8、9及其黑毛仔猪MC1R基因型均为杂合型，而红毛仔猪均表现为纯合杜洛克MC1R基因型（图3）。

2.3.2 图谱分析 使用Chromas软件查看测序峰图，结果（图4，彩插一）显示，对照样本中，母本1、2、3、4、5峰图单一，MC1R基因型为ED1/ ED1；其仔猪毛色为全黑，在碱基451、727、729处均存在双峰，MC1R基因型为杂合子ED1/e。试验样本中，母本6、7、8及黑毛仔猪在碱基451、727、729均为双峰，基因型为杂合子ED1/e；红毛仔猪峰图单一，均为纯合子，表现为杜洛克基因型e/e。不同于母本6、7、8，母本9在碱基451、727处均存在双峰，在碱基729处为单一峰，基因型为ED1/e；黑毛仔猪MC1R基因型为杂合子ED1/e；红毛仔猪MC1R基因型为纯合子e/e（表2）。

图3 窝号1、6和9 MC1R基因测序序列比对结果

表1 MC1R基因型统计

3 结论与讨论

在猪的育种中，杂交育种是现代猪育种的基本方法，可以综合各个品种的优良性状，几乎所有商品猪如杜长大都是通过杂交配套选育而来。我国地方猪品种多，遗传资源丰富，具有很多与国外猪种不同的特征。如繁殖力强、抗逆性好、肉质佳、性情温顺等；然而它们也具有生长缓慢、屠宰率偏低、背膘较厚、胴体瘦肉率低等劣势［12］。因此，适当引入外源猪种如杜洛克、巴克夏等优良公猪为父本，与中国地方猪作为母本进行杂交可以取长补短，具有明显的商业化优势。目前，在我国商品猪的生产中，以杜洛克为父本，中国地方猪为母本生产杂交品种如杜陆猪、杜湘猪等已经实现商业化。然而，杂交育种过程中也不可避免地存在性状分离现象，其中毛色分离是最直观典型的性状变化之一，严重影响商品猪的一致性。

目前，研究较为清楚的一般遗传规律是：黑色对红色为不同程度的显性遗传，表现为完全显性和不完全显性两种类型，我国多种黑猪对红色为显性遗传，巴克夏的六白对我国黑猪为隐性［13］。然而，毛色遗传较为复杂，不同品种毛色表型下的遗传背景存在差异，因此，毛色之间的显隐性关系存在变化。侯万文等［14］发现巴克夏猪为父本和民猪杂交F1代出现黑色和花色毛色分离现象，黑色仔猪占54%，花色仔猪占46%，说明民猪的黑色对巴克夏的六白具有不完全显性的特征。曾检华等［15］发现巴克夏猪为父本与陆川猪、莱芜猪、圩猪、湘西黑猪杂交，F1代出现黄毛的比例为0%、9.02%、17.37%、8.69%，说明莱芜猪、圩猪、湘西黑猪的黑毛对巴克夏的六白为不完全显性，陆川猪黑毛对巴克夏的六白为完全显性；杜洛克与陆川猪、湘西黑猪、圩猪、莱芜猪杂交后代中，F1代出现红毛比例分别为0%、11.12%、10.56%、7.43%，即表现为莱芜猪、圩猪、湘西黑猪的黑毛对杜洛克的红毛为不完全显性，而陆川猪黑毛对杜洛克红毛为完全显性。刘健等［16］统计发现，在1206头F1代杜湘猪中黑色毛个体占68.49%、红毛个体占20.32%、隐条色毛的个体占11.19%，黑色对红毛表现为不完全显性。

正常情况下，杜陆猪等表现为全黑［15］，黑色对红色表现为完全显性；而在实际生产过程中，杜陆猪群里中出现少量的毛色分离现象，部分个体毛色为红色。本试验从分子生物学角度，采用MC1R基因型分析杜陆猪毛色分离的原 因，发现对照样本中，母本陆川猪基因型为ED1/ ED1，F1代杜陆猪均为黑毛，基因型为ED1/e；试验样本中，母本陆川猪均为杂合子ED1/e，因此，杂合子陆川猪母本和杜洛克父本杂交产生MC1R基因型表现为纯种杜洛克所特有的e/e，子代表现为红毛，说明引起杜陆猪出现红毛的原因是由于母本为杂合子，而并非由杂交试验所认为的黑色对红色的显隐性关系所决定的。通过本次实验，可以对陆川猪黑毛对杜洛克红毛具有完全显性作一个侧面验证，同时，可以指导猪场以MC1R基因作为分子标记快速纯化陆川猪基础群。

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（责任编辑 崔建勋）

Analysis of MC1R genotype in F1hybrid of Duroc ×Luchuan Pig

QIN Ke1，ZENG Jian-hua2，XUE Ming3，SONG De-qing2，YANG Hong-jie3，HE Zu-yong1，LIU Xiao-hong1
（1. State Key Laboratory of Biocontrol，School of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；
2. Guangdong YIHAO Food Co.，Ltd.，Guangzhou 510620，China；
3. National Station of Animal Husbandry，Beijing 100125，China）

In order to explain the reason of coat color separation in the F1hybrid of Duroc ×Luchuan Pig populations，five litters of piglets with black coat color and the sows were studied as controls，by sequencing of PCR products，we analysed the genotype of MC1R gene in four litters of piglets with coat color separation and the sows. Sequencing results indicated that the MC1R genotype in piglets of control samples was ED1/e，and in the sows was ED1/ ED1；among the four litters of piglets with coat color separation and the sows，the MC1R genotype of black piglets，red piglets and the sows were ED1/e，e/e，ED1/e，respectively. The MC1R genotype in purebred Duroc is e/e and the purebred Luchuan pig is ED1/ ED1，the F1hybrid should be ED1/e. So the results confirmed that the sows farrowing red piglets were heterozygous and infiltrated by Duroc descent. From this study，we revealed the reason for coat color separation of Duroc ×Luchuan Pig populations from the molecular level. According to the coat color of piglets，we can quickly eliminate the heterozygous Luchuan sows.

Doroc；Luchuan pig；Dulu pig；coat color separation；MC1R gene

S813.3；Q346+.4

A

1004-874X（2017）01-0122-06

2016-12-13

国家科技基础性工作专项（2014FY120800）；广东省科技计划项目（2014B020202001）；广东省扬帆计划项目（2014YT02H042）；广东省自然科学基金（2016A030313310）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX 08006003-006）

秦珂（1989-），男，在读硕士生，E-mail：949612306@qq.com

刘小红（1970-），男，博士，研究员，E-mail：liuxh8@mail.sysu.edu.cn

秦珂，曾检华，薛明，等. 杜洛克×陆川猪杂交F1代MC1R基因型分析［J］.广东农业科学，2017，44（1）：122-127.