冬凌草甲素抑制胃癌SGC⁃7901细胞增殖诱导DNA损伤相关蛋白表达的实验研究

余韬 魏凤香，2★ 温丽娟

冬凌草甲素抑制胃癌SGC⁃7901细胞增殖诱导DNA损伤相关蛋白表达的实验研究

余韬1魏凤香1，2★温丽娟1

目的探索冬凌草甲素对胃癌细胞增殖及DNA损伤相关蛋白表达的影响。方法MTT法检测冬凌草甲素对胃癌细胞的增殖活性的影响；Westernblot检测H2AX、γH2AX、ATM、phospho⁃ATM、phospho⁃P53、P53、phospho⁃CHK2等DNA损伤相关蛋白表达的变化；免疫荧光检测冬凌草甲素对phospho⁃ATM和γ⁃H2AX焦点形成的影响。结果MTT结果显示冬凌草甲素能够抑制胃癌细胞增殖，具有剂量依赖关系；Western blot结果显示γH2AX、phospho⁃ATM、phospho⁃P53、P53、phospho⁃CHK2蛋白水平呈剂量依赖性增高；免疫荧光结果发现phospho⁃ATM、γH2AX焦点随着药物浓度增大而增多。结论冬凌草甲素可以抑制胃癌SGC⁃7901细胞增殖，诱导DNA损伤及相关蛋白表达，且具有剂量依赖性，但DNA损伤信号通路详细机制有待进一步研究。

冬凌草甲素；DNA损伤；γH2AX；phospho⁃ATM

胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，在我国各种消化道恶性肿瘤中发病率居首位［1］，且进展快、生存期短、预后较差。然而，目前治疗效果仍然不理想，几乎没有取得整体生存效率的提高。因此，寻求最有效的治疗方法是非常必要的。冬凌草甲素是一种二萜类化合物，能够抑制多种细胞增殖和诱导细胞凋亡，研究表明冬凌草甲素能对乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、宫颈癌细胞等多种肿瘤［2⁃8］细胞有抑制或杀伤作用，但冬凌草甲素对细胞的生长抑制作用方式尚不清楚。DNA损伤修复受共济失调毛细血管突变基因（ataxia⁃telangiectasia mutated，ATM）调控，ATM还能磷酸化其底物p53和细胞周期检测点激酶2（Checkpoint kinase 2，CHK2）诱导细胞周期发生阻滞［9⁃10］。在本项研究中，以胃癌SGC⁃7901细胞为研究对象，对冬凌草甲素在胃癌SGC⁃7901细胞中DNA损伤的影响和可能的机制进行了分析。

1 材料与方法

1.1 试剂

胃癌细胞SGC⁃7901由佳木斯大学基础医学院提供；冬凌草甲素（纯度为98%）、四甲基偶氮唑盐（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国sigma公司；RPMI⁃1640培养基来自美国Thermo公司；胎牛血清购自中国杭州四季青公司；兔抗人H2AX和γH2AX、鼠抗人ATM和phospho⁃ATM（S1981）均购于美国Cell Signaling公司；RNase和碘化丙啶（propidine iodide，PI）溶液均购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 四氮噻唑蓝（MTT）法分析细胞增殖

常规胰酶消化细胞，取对数期胃癌SGC⁃7901细胞接种于96孔板中，混匀后于5%二氧化碳、37° C培养箱中培养，24 h后，用不同浓度冬凌草甲素（10、20、30、40、50 μmol/L）处理细胞，同时设置对照组（细胞、培养基、0.05%DMSO，不加药物），空白组（没有细胞，加培养基、DMSO），每组设6个复孔，常规培养24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 100 μL，4 h后，吸弃各孔液体，每孔加入DMSO 140 μL，于微孔板快速振荡器震荡10 min。于酶标仪570 nm检测细胞吸光度（OD值），确定药物对细胞生长的抑制率。细胞抑制率（%）=（A对照组⁃A实验组）/（A对照组⁃A空白组）×100%。

1.2.2 Western blot检测相关蛋白

不同浓度的冬凌草甲素（0、10、20、40 μmol/L）处理细胞24 h后，取出6孔板置于冰上，吸弃培养液，冰PBS处理2次，加入细胞裂解液，在冰上裂解30 min后，收集蛋白于EP管后，利用考马斯亮蓝法（波长595 nm）测定蛋白浓度，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶电泳后，进行免疫印迹，将蛋白转移醋酸纤维膜（NC）上，浸没于5%牛血清白蛋白液封闭1 h，然后用一抗，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，TBST洗膜4次，每次10 min；二抗室温下孵育1 h，孵育完后用PBST洗膜4次，每次10 min。然后用ECL发光液显色曝光，β⁃actin作为内参蛋白。

1.2.3 免疫荧光检测γ⁃H2AX、phospho⁃ATM焦点

调整细胞浓度1×105/mL，接种于6孔板中，不同浓度冬凌草甲素（10、20、40 μmol/L）处理细胞，孵育24 h后，冰PBS洗3次，4%聚甲醛固定30 min，PBS洗3次、5 min/次；室温下用0.3% Triton X⁃100对胃癌SGC⁃7901细胞通透处理30 min，PBS轻轻漂洗3次；Blocking buffer 200 μL室温封闭1 h；1∶50一抗4℃孵育过夜；荧光二抗孵育1 h后，0.5 μg/mL的DAPI室温避光孵育10 min后，冷风吹干，加入抗淬灭剂，用荧光显微镜计数，每张玻片至少100个细胞，然后观察荧光焦点，采集图像，每组实验重复3次。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖变化

不同浓度冬凌草甲素（10、20、30、40、50 μmol/L）均可抑制胃癌SGC⁃7901细胞生长，且随时间延长及药物浓度的增加，作用逐渐增强，呈时间剂量依赖性，见表1，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Western Blot印迹检测DNA损伤相关蛋白表达

不同浓度的冬凌草甲素（0、10、20、40 μmol/L）处理 SGC⁃7901细胞 24 h后，phospho⁃ATM、γH2AX、phospho⁃P53、P53、phospho⁃CHK2蛋白水平随着药物浓度的增加而增加，见图1。

表1 不同浓度冬凌草甲素对胃癌细胞SGC⁃7901的抑制率（±s，%）Table 1 Oridonin’s inhibition rate against SGC⁃7901 gastric cancer cells by MTT assays（±s，%）

表1 不同浓度冬凌草甲素对胃癌细胞SGC⁃7901的抑制率（±s，%）Table 1 Oridonin’s inhibition rate against SGC⁃7901 gastric cancer cells by MTT assays（±s，%）

时间(h)/浓度（μmol/L）12 24 0 0 0 10 13.6±2.15 15.9±2.12 20 23.4±2.07 26.1±2.01 30 67.9±2.19 69.1±2.20 40 93.2±2.04 93.8±2.03 50 94.5±2.09 95±2.02

图1 Western Blot印迹检测DNA损伤相关蛋白表达Figure 1 Expression of DNA damage related proteins by Western Blot

2.3 冬凌草甲素对phospho⁃ATM和γ⁃H2AX焦点形成的影响

DNA双链断裂时，ATM在断裂处活化为phospho⁃ATM，然后使H2AX磷酸化形成γH2AX并结合到断裂点处，本实验采用特异性荧光抗体（二抗），抗体结合到断裂点后在荧光显微镜下显示为荧光焦点，一个焦点代表一处DNA损伤，焦点越多说明DNA断裂点越多，DNA损伤越严重。本实验对照组没有荧光焦点的形成，而实验组phospho⁃ATM（绿色）和γ⁃H2AX（红色）焦点随着冬凌草甲素浓度的增加而增加，见图2。

图2 冬凌草甲素对胃癌SGC⁃7901细胞phospho⁃ATM和γ⁃H2AX焦点形成的影响Figure 2 Oridonin’s effects on ATM phosphorylation and γ⁃H2AX foci formation

3 讨论

冬凌草甲素是一种二萜类化合物，具有治疗咽喉肿痛、毒蛇咬伤、昆虫叮咬的作用，还用于扁桃体炎症，在20世纪70年代早期被证明具有抗癌活性［11］，研究证明冬凌草甲素能够直接抑制多种肿瘤细胞的增殖［12］，其抗癌作用机制有以下几点：1）抑制肿瘤增殖；2）诱导肿瘤凋亡、自噬及坏死［13］。研究表明，冬凌草甲素可抑制SGC⁃7901细胞增殖和诱导细胞凋亡，并且阻滞于G2/M期，其凋亡机制可能与降低bcl⁃2蛋白表达以及激活Caspase⁃3激活相关［14⁃15］，邱冰等［9］研究证明冬凌草甲素可以诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤，并且使H2AX蛋白发生磷酸化。

外部环境和生物体自身因素都会导致DNA分子的损伤，受损的DNA可以激活细胞周期检查点，并诱导细胞在细胞进入有丝分裂期之前修复受损的DNA，从而保持基因组的完整性［16］。如果DNA的损伤或遗传信息的变化不能修正，会导致细胞增殖失控，最终导致癌变，所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在［17］。DNA损伤可诱导H2AX磷酸化和激活ATM，它们可以检测DNA的损伤，并将信号传向下游目标蛋白并促进细胞周期阻滞，完成DNA损伤修复或诱导细胞凋亡［18⁃20］。

DNA损伤可以诱导H2AX（γ⁃H2AX形式）的磷酸化，其已被认为是检测DNA损伤的金标准［26］。在本研究中，免疫荧光及Western Blot结果显示phospho⁃ATM、γ⁃H2AX表达量增加，证实冬凌草甲素能够诱导DNA损伤，并且随着药物浓度逐渐增加，DNA损伤逐渐加重。Western Blot显示phospho⁃ATM、γ⁃H2AX、phospho⁃CHK2、phos⁃pho⁃P53、P53蛋白水平呈增加趋势，表明冬凌草甲素通过激活“ATM⁃p53⁃CHK2”通路诱导G2/M期阻滞，损伤后的DNA诱导H2AX蛋白的磷酸化，随后通过ATM的自磷酸化（S1981）激活ATM［22⁃26］，在相关调节蛋白的参与下，将DNA损伤信号传递到下游蛋白并作用于效应蛋白，这导致细胞周期停滞，DNA修复或者细胞凋亡。虽然本实验验证了DNA损伤相关蛋白水平变化，但本实验还存在一些限制，下游相关效应蛋白的表达没有完全通过Western印迹评估，这使得冬凌草甲素诱导的胃癌SGC⁃7901细胞DNA损伤的详细机制受到限制，需要进一步的实验来解决这些问题。总之，数据表明，冬凌草甲素可以通过激活ATM及H2AX，使得phospho⁃ATM及γ⁃H2AX蛋白水平及荧光焦点随着药物浓度的增加而增加，DNA损伤程度随着药物浓度的增加而加重。

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The effect of oridonin on proliferation and expression of DNA damage⁃related proteins in gastric cancer cells

YU Tao1,WEI Fengxiang1,2★,WEN Lijuan1
（1.Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou,China,563000;2.Central Laboratory,Maternal and child health care hospital of Longgang District,Shenzhen,Guangdong,China,518172）

ObjectiveTo investigate the effect of oridonin on proliferation and DNA damage⁃related protein expression in gastric cancer cells.MethodsThe effect of oridonin on the proliferative activity of SGC⁃7901 gastric cancer cells was assessed with the MTT assay.The expressions of γH2AX,H2AX,ATM, phospho⁃ATM,phospho⁃P53,P53 and phospho⁃CHK2 were detected using western blot.The effect of oridonin on the phosphorylation of ATM and the formation of γH2AX foci was examined with immunofluorescence.ResultsThe MTT assay revealed that oridonin can inhibit SGC⁃7901 cell proliferation in a dose⁃dependent manner.Exposure of SGC⁃7901 cells to oridonin in varying concentrations results in a significant dose⁃dependent increase in the SGC⁃7901 cell inhibition rate.Western blot analysis showed that SGC⁃7901 cells exposed to oridonin exhibited a dose⁃dependent increase in the level of γH2AX,phospho⁃ATM,phospho⁃CHK2,phospho⁃P53 and P53 proteins.Additionally,the higher doses of oridonin increase γH2AX and phospho⁃ATM foci formation.ConclusionOridonin can inhibit the proliferation of SGC⁃7901 gastric cancer cells and induce DNA damage and the expression of related proteins in a dose⁃dependent manner.Higher concentrations of oridonin lead to the increase in expression of several DNA damage⁃related proteins and their phosphorylation. Further investigation of the underlying molecular mechanisms of the DNA damage signaling is necessary.

Oridonin;DNA damage;γH2AX;phospho⁃ATM

广东省自然科学基金项目（2014A030313749）

1.遵义医学院，贵州，遵义563000 2.深圳市龙岗区妇幼保健院中心实验室，广东，深圳518172

★通讯作者：魏凤香，E⁃mail：haowei727499@163.com