猪高致病性蓝耳病、圆环病毒病和链球菌病混合感染的诊断

孙光野，张洪友＊

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

猪高致病性蓝耳病、圆环病毒病和链球菌病混合感染的诊断

孙光野，张洪友＊

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

为了对黑龙江省某猪场发生的猪病确诊，首先采用了流行病学调查、临床检查和病理解剖初步怀疑是猪圆环病毒病和链球菌病混合感染，然后无菌取病猪脾脏、淋巴结进行细菌分离，分离纯化后的细菌经革兰氏染色、生化实验和动物实验，鉴定为猪链球菌；提取脾脏和淋巴结DNA、RNA经PCR检测出猪圆环病毒和猪高致病性蓝耳病毒的核酸阳性条带。说明了该病猪确系猪圆环病毒、猪高致病性蓝耳病毒和猪链球菌的混合感染。药敏试验结果表明，该分离菌对青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素不敏感，对头孢咪唑、环丙沙星、氟哌酸高度敏感。并结合猪场的发病情况和试验结果提出了防疫方案和治疗措施，为猪场防治猪圆环病毒病、猪高致病性蓝耳病与链球菌混合感染提供了参考。

猪高致病性蓝耳病；猪圆环病毒病；猪链球菌病；混合感染

猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒引起的猪的一种新的传染病。其临诊表现多种多样，主要特征为体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难、母猪繁殖障碍、内脏器官及皮肤的广泛病理变化，特别是肾、脾脏及全身淋巴结的高度肿大、出血和坏死。本病还可导致猪群产生严重的免疫抑制[1]，从而容易导致继发或并发其他传染病。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）俗称猪蓝耳病，是由病毒引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病[2]。其特征为厌食、发热、母猪怀孕后期发生流产，产死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡。高致病性猪蓝耳病（HPRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变异株引起的一种急性高致死性疫病。PRRSV 容易发生变异，最直接有力的证据就是高致病性蓝耳病病毒出现毒力增强的现象[3-5]。

猪链球菌病是由链球菌属中致病性链球菌所致的一种传染病。多发于3～12 周龄的猪，尤其是断奶仔猪易感染此病，临床上主要表现为淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎以及败血症等症状，给养猪业造成了巨大的经济损失。

2016年10月15日，黑龙省某猪场送来2头7周龄的病猪，通过流行病学调查得知，该猪场规模400头，发病猪70头，每天死亡8头左右，发病率17.5%，死亡率2%。发病的猪食欲废绝，体温升高，跛行。通过对送检病猪观察，表现为精神委顿、喜卧不动、呼吸困难、眼睑水肿、粪便稀便。然后病理剖检发现肠系膜淋巴结水肿、肾脏周围脂肪水肿；脾脏肿大、坏死、色暗；肺脏充血；胃肠黏膜出血。初步怀疑是猪圆环病毒和链球菌感染，但病理剖检情况复杂，无法确诊，所以还需进行实验室诊断来确诊。

1 材料

1.1 病料及试验动物

无菌取该猪场送检病猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结。

试验动物为4只8周龄的小白鼠，黑龙江八一农垦大学预防教研室提供。

1.2 试剂及仪器

Marker购自大连宝生物工程有限公司；TIANamp Virus DNA/ RNA Kit 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；RevertAid Fir st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录盒购自MBI公司。革兰氏染液购自青岛海博生物技术有限公司；药敏片购自广州市宜康生物科技有限公司；鲜血琼脂培养基由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学实验室制备；普通肉汤培养基购自上海研生实业有限公司；微量生化管购自杭州天和微生物试剂有限公司；电子显微镜（型号为OlympusCX3）购自南京艾朗仪器有限公司；紫外凝胶成像分析系统（型号为Gel Doc 2 000）购自美国Bio-RAD公司；PCR仪（型号为TP600）购自宝生物工程(大连)有限公司。

2 方法

2.1 细菌分离培养和染色镜检

将无菌采取的肝脏、肺脏接种于血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落形态。涂片镜检后挑取单个菌落进行纯化培养。

2.2 生化试验

无菌取分离菌纯培养物分别接种于葡糖糖、甘露醇、麦芽糖、木糖、棉籽糖，乳糖、肌醇微量生化管中，同时进行M.R.试验和V-P试验。37 ℃培养24 h后观察其生化反应特性。

2.3 动物试验

挑取纯化后的单菌落，经营养肉汤培养后经生理盐水稀释制成细菌悬液（5×106cfu/mL），脑内注射2只8周龄小鼠，剂量为0.2 mL/只，对照组的两只小鼠注射同等剂量的生理盐水，观察结果。

2.4 药敏试验

挑取纯化后的单菌落，经营养肉汤培养后吸取100μL 滴在血琼脂培养基上，用灭过菌的三角棒均匀涂抹于血琼脂平板表面，以确保细菌能在平板上广泛生长。用无菌镊子将药敏片分别贴于培养基表面，各药敏片间隔一定距离。37 ℃培养24 h后观察结果，测定抑菌圈直径。

2.5 病毒基因组的提取

将剖检猪的脾脏和淋巴结充分研磨，按照 TIANamp Virus DNA/ RNA Kit 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书的操作步骤分别提取病毒的DNA和RNA，按RevertAidFirst S trand cDNA Synthesis Kit 反转录盒的说明书操作步骤将提取的病毒RNA进行反转录，得到病毒 cDNA。

2.6 PCR检测

以试剂盒提取得到的病毒DNA、反转录得到cDNA为模板，用猪瘟病毒、普通猪蓝耳病毒、猪高致病性蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒、圆环病毒的特异性引物进行PCR反应扩增，PCR产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用紫外凝胶成像仪分析。

3 结果

3.1 细菌的分离培养结果

从37 ℃培养24 h的血琼脂培养基中，可见长出灰白色、圆形、光滑、湿润、边缘整齐半透明的小菌落，菌落周围形成β溶血环。

3.2 革兰氏染色结果

将病料中所分离的细菌进行纯培养，然后对其进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见到革兰氏阳性链状球菌，结果见图1。

图1 细菌革兰氏染色结果（10×10）

3.3 生化试验结果

37 ℃恒温箱中培养24 h，结果见表1。由表1可知，鉴定结果符合猪链球菌的生化特性。

表1 生化特性试验结果

3.4 动物致病性试验结果

脑内注射2只8周龄小白鼠，小鼠在28 h均死亡，对照组没有死亡。无菌取死亡小白鼠的肺脏、淋巴结和脾脏接种在血琼脂培养基上，结果分离鉴定与以上的猪链球菌一致。

3.5 药敏试验结果

该分离菌对青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素已经产生了较强的耐药性；对头孢咪唑、环丙沙星、氟哌酸高度敏感，结果见表2。

表2 药敏试验结果

3.6 PCR扩增结果

以得到的病毒DNA、反转录得到cDNA为模板，用猪瘟病毒、猪普通蓝耳病毒、猪高致病性蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒、圆环病毒的特异性引物进行PCR扩增，引物由哈尔滨博仕生物有限公司合成。引物序列、扩增基因名称及大小见表3，结果见图2。

图2 PCR产物琼脂糖凝胶电

表3 引物列表

4 讨论

通过对黑龙江省某猪场送检的病猪进行流行病学调查、临床检查和病理解剖，初步怀疑是猪圆环病毒与猪链球菌的混合感染，但病理解剖情况复杂，无法确诊。然后通过实验室诊断确诊为猪圆环病毒、猪高致病性蓝耳病毒和链球菌的混合感染。虽然该猪场接种了猪圆环疫苗，但抗体水平不足以抵抗病毒的侵袭，造成疫病流行，所以应制订合理的免疫程序，合理地投喂抗生素，避免继发感染。链球菌在血液琼脂平板上会出现溶血的现象，可分为α、β、γ三种类型溶血链球菌。根据以上分类标准，结合该菌在血琼脂培养基出现的溶血现象可判断为β型溶血链球菌。根据药敏试验结果，该分离菌对青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素已经产生了较强的耐药性，这应该是猪场滥用抗生素所致，对头孢氨苄、环丙沙星、氟哌酸高度敏感，可能是猪场未广泛使用。因此可以把头孢氨苄、环丙沙星、氟哌酸作为治疗链球菌的首选药物。

因为目前国际上还没有有效的疫苗用于PCV2感染的免疫预防[6]，因此控制PCV2感染的主要措施包括：加强环境消毒和饲养管理，减少仔猪应激。感染PRRS病猪从恢复期开始即可产生免疫力，对于再次感染PRRSV均有抵抗力。因此，在地方流行性区域内给猪接种疫苗对预防繁殖障碍是比较有效的。患链球菌的动物，自愈后机体所产生的免疫力，足可抵御链球菌再感染。因此，应用疫苗进行免疫接种，对预防和控制本病传播效果显著。

近年来随着集约化猪场的发展，猪场的疾病情况变得越来越复杂，病毒性疾病混合感染细菌性疾病日趋严重[7]，猪的死亡率也越来越高，造成了严重的经济损失。作为猪场经营管理者，平时应建立和建全消毒隔离制度。保持圈舍清洁、干燥及通风，经常清除粪便，定期更换垫草，保持地面清洁。引进动物时必须经检疫和隔离观察，确认健康时方能混群饲养。制订合理的免疫保健程序，加强管理，冬季做好防风防冻措施，增强猪的自身抗病力，也是预防疾病的重要措施。

[1] 董林.猪圆环病毒2型诊断试剂盒的研制与应用[D].长春：吉林大学，2014.

[2] 伍和明，谢齐斌，李东生，等.桂林市高致病性猪蓝耳病流行病学调查 [J].中国动物检疫，2013(12)：46-47.

[3] 王荣.猪瘟和蓝耳病快速检测方法的建立和应用[D].福州：福建农林大学，2009.

[4] MORTENSEN S，STRYHN H，SGAARD R，et al. Risk factors for in-fection of sow herds with porcine reproductive and respiratorysyndrome (PRRS) virus [J]. Prev Vet Med，2002，53 (1/2)：83-101.

[5] LABARQUE G ，REETH KV ， NAUWYNCK H， et al. Impact of genet-is diversity of European-type porcine reproductive and respiratorysyndrome virus strains on vaccine efficacy [J].Vaccine，2004，22(31/32)：4183-4190.

[6] 王一平，郭龙军，唐青海，等.猪圆环病毒2型疫苗的研究进展[J].畜牧兽医学报，2012，43(9)：1337-1345.

[7] 谢嘉林，王立功，谢占民.中小规模猪场的疾病防控措施 [J].湖北畜牧兽医，2015，36(6)：36-37.

2016-11-17）

孙光野 (1992- ),男,硕士研究生，研究方向为动物营养代谢病，940495242@qq.com.

*通信作者：张洪友(1960- ),男，硕士,教授，硕士生导师，研究方向为动物营养代谢病.