15N自然丰度法分析甘蔗及近缘属野生种固氮效率

罗 霆，李长宁，李毅杰，谢金兰，梁强，刘晓燕，王维赞，周忠凤，李杨瑞

15N自然丰度法分析甘蔗及近缘属野生种固氮效率

罗 霆，李长宁，李毅杰，谢金兰，梁强，刘晓燕，王维赞，周忠凤*，李杨瑞*

（广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点试验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点试验室，南宁530007）

利用15N同位素自然丰度法，在连续两年不施氮肥条件下，对甘蔗及近缘属野生种（材料）的固氮效率进行对比分析，同时筛选出适宜本试验研究的参比植物。试验结果表明，河八王及其后代材料表现出明显的高固氮能力，最高固氮率达到36.13%，最低的为甘蔗栽培种ROC22，固氮率仅为5.72%。银胶菊、胜红蓟和狗尾草与河八王1-1号的δ15N值之差为3.13～3.50，是分析甘蔗及近缘属野生种固氮效率较理想的参比植物。

甘蔗近缘属；15N自然丰度法；河八王；固氮效率

甘蔗是重要的糖料和能源作物。广西是仅次于巴西圣保罗的世界第二大产糖省（区），甘蔗栽培面积占全国的65%以上，年产糖8500万吨左右。氮是甘蔗的重要元素，甘蔗植株氮含量占干重的0.3%～2%，每生成1t蔗糖需氮7 kg。广西每年氮肥投入约55万吨，折合人民币9.3亿元。在产量相当的情况下，广西氮肥用量为100～755 kg/hm2，是巴西的6～10倍，超过世界平均水平的3倍以上，而收获物中肥料氮含量仅为7.5万吨，氮肥利用效率不到15%[1]。大量、单一的化学氮肥施用使得甘蔗生产成本居高不下，同时造成硝酸盐累积和土壤理化性质破坏[2-3]。在持续提高甘蔗产量的同时，控制或降低氮肥的施用量，已经成为甘蔗种植国面临的重要科学问题[4-5]。

研究报道指出，一些甘蔗品种通过与内生细菌联合固氮，能为植株提供大量的氮素，但不同甘蔗基因型在氮肥利用效率上有较大差异，巴西甘蔗品种通过固氮提供所需氮素的25%～85%[6]；墨西哥的甘蔗品种固氮率在10%～67%[7]；泰国品种约30%[8]；我国报道的甘蔗品种固氮率在10%~30%之间[9-10]。甘蔗的联合固氮是一个受环境条件、固氮菌种类、甘蔗基因型等多因素影响的复杂生理生化过程，但基因型的差异是其中的最主要原因。为此，甘蔗高固氮及氮高效品种选育是解决我国甘蔗大量施用氮肥和氮肥利用效率低的最重要途径。

甘蔗远缘杂交是将野生种属中的有利基因转入甘蔗品种（系），从而创造变异，是获得优良新品种或育种中间材料的有效途径。河八王属河八王（Narenga porphyrocoma）、蔗茅属斑茅[Erianthus arundinacius（Retz.）Jesws.]和甘蔗属野生种割手密（Saccharum spontaneum L.），在常年低氮条件下不表现缺氮症状并保持高生物量的氮高效特性，同时兼具抗逆性、适应性、分蘖及宿根性等方面的优势，使其成为国内外甘蔗种质资源创新研究利用的热点。但目前还没有将甘蔗及近缘属野生基因资源应用于甘蔗氮高效育种并建立有效的育种技术体系的研究报道，且对其氮高效的生理生态机制也缺乏深入研究。本研究通过在低氮条件下对甘蔗近缘属斑茅和河八王以及甘蔗属野生种割手密固氮效率的研究，探讨斑茅、河八王和割手密在甘蔗氮高效基因型选育中的利用价值，以期为甘蔗野生基因资源应用于甘蔗氮高效育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

参试材料来自广西甘蔗资源圃，包括河八王、桂糖系列新品种（系）、新台糖、斑茅、割手密、斑茅割手密复合体及其与甘蔗的杂交后代。用于同位素自然丰度法测定的参比植物为木薯及农田中自然生长的银胶菊、胜红蓟、狗尾草和抓根草。参试材料见表1。

1.2 方法

1.2.1 种植和取样方法 试验材料于4月5日种植于广西农科院甘蔗研究所试验场，随机区组设计，设3个重复。全生育期不施肥，不除草。在伸长期（7月2日）取样测定。取甘蔗及近缘属材料+2叶，取参比植物第2张成熟叶，放入通风干燥器内，在70℃以下烘干48h，将叶片用粉碎机粉碎后过0.5mm细筛，装入密封塑料袋备用。

1.2.2 固氮效率测定方法 甘蔗及近缘属材料伸长期固氮能力测定采用15N自然丰度法[11]。将备用样品送上海化工研究院，利用比例同位素质谱仪进行同位素测定。

固氮效率计算：%Nfixed=（15Nref-15Nfield）/（15Nref-15Nhydro）

其中15Nref代表参比植物，即与固氮植物生长在相同环境下的非固氮植物组织的δ15N值，δ15Nfield代表野外固氮植物组织的δ15N值，15Nhydro代表在无氮溶液中水培生长的固氮植物组织的δ15N值（本研究中15Nhydro以δ15Nfield-0.002的差值代替）。

15N原子百分超计算：

其中 δ15N为样品的15N与大气15N的千分差，atom%15N（sample）为样品15N原子丰度，atom%15N（standard）为大气标准15N原子丰度。

1.2.3 数据分析方法 数据整理、分析用Excel软件和SPSS14.0软件。

2 结果与分析

2.1 参比植物选择

利用15N自然丰度法计算植物固氮效率，对参比植物的要求较高。本试验参比植物有木薯、银胶菊、胜红蓟、狗尾草和抓根草。一般来说，固氮植物和非固氮植物的atom%15N之差约为3～5δ15N值[12]，本试验所用参比植物的atom%15N及与所有参试材料中atom%15N较小的河八王1号的atom%15N之差列于表2。结果表明，供试参比植物的atom%15N介于0.36984～0.37249之间，与河八王1号的atom%15N之差介于2.42～8.50之间，说明在本试验中，以胜红蓟、狗尾草和银胶菊为非固氮的参比植物，能计算出较合理的固氮效率。

2.2 甘蔗及近缘属材料固氮能力比较

选取银胶菊为参比的非固氮植物，计算出参试材料的固氮效率（表3）。在本试验连续两年不施氮肥和以银胶菊为参比的情况下，固氮效率最高的是NSF110，达到36.13%，其次是河八王1-1号和河八王2-6号，固氮率分别为26.64%和25.25%。其中NSF110为河八王1-1号与甘蔗栽培种的杂交F1。ROC22固氮效率最低，仅为5.72%。ROC22为当前广西的甘蔗主栽品种，其具有高产高糖等优良特性，但在栽培上对氮肥的需求量较大。

3 讨论

利用15N自然丰度法估计固氮植物的生物固氮比例，一般要求参比植物与固氮植物有相似的物候特征、根系分布特征、形态特征，并且参比植物利用与固氮植物相似的土壤氮源，反映出固氮植物所利用的土壤氮素的15N丰度，否则会产生很大误差[13]。为了减少测量结果的误差，本研究选取与参试植物在同一地块生长的木薯及一些草本植物作为参比，并最终选择δ15N差值为3.50的银胶菊作为参比植物计算固氮效率，得到的固氮效率在5.72%～36.13%之间，说明所选参比植物是合理的。

参试的甘蔗及近缘属材料中，河八王及其部分后代材料表现出明显的高固氮能力，说明其体内很可能存在高效的氮转化利用机制。而在当前的甘蔗选育中，对河八王的研究和利用鲜见报道，对其高固氮生理机制的研究更是空白，本项目组计划在下一步开展相关研究。本研究中斑茅和割手密及其后代材料没有表现出明显的固氮优势，但在实际中，斑茅和割手密对贫瘠缺氮环境有很强的适应能力，有可能本研究仅分别选择了1个斑茅和1个割手密及其后代，研究对象太少，故此不能真实反映出不同基因型的斑茅和割手密的真实固氮能力和氮利用效率。

表1 参试材料

表2 参比植物的atom%15N及与河八王1-1 号的atom%15N 之差

表3 苷蔗及近缘属材料固氮效率

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Identification of Biological Nitrogen Fixation Efficiency in Sugarcane and its Related Genera by15N Natural Abundance Method

LUO Ting,LI Chang-ning,LI Yi-jie,XIE Jin-lan,LIANG Qiang,LIU Xiao-yan, WANG Wei-zan,ZHOU Zhong-feng*,LI Yang-rui*

(Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Science/Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement(Guangxi),China Ministry of Agriculture,Nanning 530007)

The nitrogen fixation efficiency of sugarcane and its related genera were analyzed by15N natural abundance method for two consecutive years without nitrogen fertilizer application.The results showed that the Narenga porphyrocoma(Hance)Bor.and it's progeny had relatively higher nitrogen fixation rate(NFR)compared with other sugarcane and related genera,the highest NFR reached 36.13%,and the lowest was commercial varieties ROC22 of 5.72%.The differences of δ15N between the Narenga porphyrocoma (Hance)Bor and the reference plants(guayule,tropic ageratum herb and green bristlegrass)ranged from 3.13 to 3.50,which were ideal reference plants to calculate nitrogen fixation efficiency in sugarcane and its related genera.

related genera of sugarcane;15N natural abundance method;Narenga porphyrocoma (Hance)Bor.; nitrogen fixation efficiency

S566.103

A

1007－2624（2017）01－0004－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.002

2016-11-04

广西农科院科技发展基金“斑割复合体杂交利用过程中特异性基因遗传重组研究”（桂农科2016YM04）和甘蔗新品种桂糖47号中试与示范（农成转2016001）；广西自然科学基金项目“河八王片段代换系构建及特异基因遗传分析”（2014GXNSFBA118115）；广西“八桂学者”专项经费。

罗 霆（1980-），女（壮族），广西鹿寨人，副研究员，研究方向：甘蔗生理，邮箱：seafair@163.com

李杨瑞（1957-），男，广西北流人，教授，研究方向：甘蔗生理，邮箱：liyr@gxaas.net周忠凤（1974-），女，高级农艺师，研究方向：甘蔗新品种选育及栽培生理，邮箱：445708586@qq.com