针刀干预对帕金森病模型大鼠行为学及谷胱甘肽的影响*

梁靖蓉，郭长青，芦 娟，杜宁宇，马薇薇，朴起范，吴 彤，徐 菁，赵瑞利，马 田，陈 晨，安 娜，卢胜春

(北京中医药大学，北京100029)

针刀干预对帕金森病模型大鼠行为学及谷胱甘肽的影响*

梁靖蓉，郭长青△，芦 娟，杜宁宇，马薇薇，朴起范，吴 彤，徐 菁，赵瑞利，马 田，陈 晨，安 娜，卢胜春

(北京中医药大学，北京100029)

目的:观察针刀对帕金森病(PD)大鼠行为学及谷胱甘肽(GSH)含量的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组和针刀组(各16只)，采用右侧纹状体双靶点注射6-羟多巴胺造模。电针组“百会”沿皮向双侧“太阳”透刺，每次20 min;针刀组取枕骨下项线中点和C1、C2横突后结节进行松解。进行行为学评价和黑质GSH含量检测。结果:空白组未见旋转行为，模型组干预治疗前后无差异(P＞0.05);针刀大鼠旋转圈数明显减少且治疗前后相比有差异(P＜0.01);电针组治疗前后相比有差异(P＜0.05)。GSH含量比较，模型组GSH含量明显降低与空白组相比差异明显(P＜0.01);针刀组和电针组GSH含量明显升高，针刀组、电针组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)。结论:针刀可能通过改善PD旋转行为、提升GSH含量从而提高抗氧化能力减轻黑质DA能神经元损伤。

针刀干预;帕金森病;氧化应激;谷胱甘肽

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种以中脑黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元进行性丢失为基本病理改变的中枢神经系统退行性疾病，主要临床特征包括震颤、强直、运动迟缓、姿势及步态异常等［1］。PD发病率逐年增高，在65岁以上的老年人，患病率高达1%［2］。该病起病隐匿，致残率高，严重影响患者的健康和生活质量［3］。氧化应激过度及自由基损伤是PD发病机制的关键环节［4］。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是脑内最重要的抗氧化保护剂之一，可清除自由基。GSH在黑质多巴胺神经元上的耗竭极有可能是PD发病机制中的重要原因之一［5］。研究发现针灸等方法可缓解PD的症状，减少副作用，改善并发症［6］，提高GSH水平［7-8］。针刀疗法是新的医疗过程，结合中医和现代西方医学，近年来运用于PD治疗收到明显疗效。本实验观察针刀对PD模型大鼠行为学及中脑黑质非酶抗氧化物质GSH含量的影响，初步探讨针刀治疗对PD模型抗氧化应激的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用76只雄性清洁级SD大鼠(190～210 g)，购于北京维通利华公司实验动物中心［生产许可批号: SCXK(京)200223］。于北京中医药大学针灸推拿学院针灸机理实验室饲养，环境控制在温度(20±1)℃，湿度50%，12 h光暗周期。给予自由进食和饮水。适应性喂养1周后进行造模，大鼠手术前后12 h禁食不禁水。本实验所有操作按照世界卫生组织的国际生物医学研究指导原则进行，动物的伦理和使用由北京中医药大学批准。

1.2 实验仪器与试剂

脑立体定位仪(美国Stoelting公司);微量进样器(上海安亭微量进样器厂);AE-160电子天平(瑞士MET-TLER公司);一次性汉章系列无菌针刀(规格: 0.4 mm×40 mm，北京健力园医疗器械有限公司);一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm)和韩氏电针仪(北京中研太和医疗器械有限公司);6-羟多巴胺(6-OHDA)和阿朴吗啡(APO)(美国Sigma公司);水合氯醛(天津市科密欧化学试剂中心);多聚甲醛(常德市华生医疗器械有限公司);0.9%氯化钠溶液(哈药集团三精制药有限公司);HE染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);GSH含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 PD动物模型建立

随机抽取16只作为空白对照组，剩余60只用于模型制备。采用右侧纹状体双靶点注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)造模［9］。首先10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，颅平位固定大鼠，备皮消毒暴露前囟，右侧纹状体两点坐标按《大鼠脑立体定位图谱》［10］确定(AP:-0.7 mm，L:-3.0 mm，DV:-4.5 mm;AP:-0.2 mm，L:-2.6mm，DV:-6.0 mm)。钻孔后，选用微量注射器(10 μL)以0.5 μL/min速度分别向每点注射6-OHDA(15 μg)，留微量注射器5 min，以1 mm/min的速度缓慢退微量注射器。两点颅骨孔用明胶海绵填塞减少渗血。缝合头皮后，腹腔注射青霉素钠(8万U)以防感染。大鼠分笼，保暖，待清醒伤口愈合后合笼。

模型评价:术后第4周进行行为学检测，每周2次，连续2周。腹腔注射APO(0.5 mg/kg)诱发大鼠向左侧(健侧)旋转行为。注射10 min后开始记录大鼠旋转的启动时间，旋转较稳定后记录旋转圈数持续30 min。每一个360度旋转计数1次，平均转速超过7转/min转向左侧视为成功模型。结果显示，48只大鼠符合成功模型，造模成功率为80%。

1.4 动物分组

将造模成功的动物随机分成3组，每组16只。故分组为空白组、模型组、针刀组、电针组，每组各16只。

1.5 干预措施

1周后开始治疗。空白组和模型组在实验过程中每天只抓取动物，不作任何处理，正常饲养。电针组用自制袜套固定大鼠，手法轻柔，让大鼠不强烈挣扎和嘶叫，参照李忠仁主编的《实验针灸学》［11］取“百会”“太阳”穴，用毫针(0.25 mm×25 mm)针刺“百会”，并沿皮向单侧“太阳”透刺，下次治疗刺另一侧“太阳”，交替使用，稍作提插后连接韩式电针仪(100 Hz，1 mA)，幅度以大鼠头部微颤为宜，但不引起动物挣扎嘶叫。每次留针20 min。每周3次，共4周。

针刀组大鼠用自制袜套固定大鼠，手法轻柔，让大鼠不强烈挣扎和嘶叫。取枕骨下项线中点、C1和C2横突后结节3点，常规备皮，以龙胆紫定位，常规消毒。选用0.4 mm×40 mm的HZ系列一次性针刀，左手拇指尖按压于枕骨下项线点，在枕骨下项线中点处进针，沿枕骨骨面刺入10 mm;左手拇指尖按压抵住横突后结节，在C1和C2横突后结节处进针，右手拇食中指捏住刀柄，将针刀沿左手拇指指甲背加压刺入。每周2次，共4周。

1.6 取材与指标检测

1.6.1 行为学评价 治疗结束1周后，用APO诱导各组大鼠进行行为学评价。评价方法同模型评价方法。评价后进行取材。

1.6.2 中脑黑质HE染色 行为学评价结束后，各组大鼠随机选取8只进行取材用于灌注。用10%的水合氯醛腹腔麻醉，待其麻醉后暴露心脏，将灌注针插入心尖搏动处后剪开右心耳。将生理盐水注射液(100 ml)快速灌入心脏，待右心耳血液流尽流出无色液体后改用4%多聚甲醛固定液灌注(250 ml)，等待大鼠鼠尾变硬，身体挺直，四肢僵硬变白停止灌注。快速取脑，放于含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液的EP管固定1周以备检测。标本经固定后，石蜡包埋，切片，切片厚度为5 μm，脱蜡，染色。常规脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察背根神经节的病理改变。

1.6.3 各组大鼠纹状体GSH含量水平检测 剩余8只进行取材用于匀浆。用10%的水合氯醛腹腔麻醉，待其麻醉后迅速用闸刀断头处死，迅速开颅暴露脑组织，置于放冰的玻璃器皿上，参照《大鼠脑立体定位图谱》［10］快速分离大脑皮层后取右侧黑质，放于标记好的试管中后，保存于-70℃液氮中待测。将标本取出制成组织匀浆(100 g/L)，用离心机离心(3000转/min) 15 min，取上清液，配制成适当的浓度，按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书步骤进行测试。

1.7 统计学处理

实验数据处理和分析结果使用 SPSS22.0 (20150408-LSBJ，北京中医药大学，中国)软件进行统计。实验数据以均数±标准差(±s)表示，对各数值变量进行方差齐性和正态性检验，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，行为学治疗前后旋转圈数统计运用配对t检验。检验显著性水平P＜0.05和P＜0.01。

2 结果

2.1 行为学评价

各组行为学评价结果显示，空白组未见旋转行为，模型组出现旋转行为且干预治疗前后旋转圈数无差异(P＞0.05);针刀组干预后大鼠活动有所增多，旋转圈数明显减少，治疗前后相比有明显差异(P＜0.01)，且与模型组相比有差异(P＜0.01);电针组治疗前后相比有明显差异(P＜0.05)，且与模型组相比有差异(P＜0.05)，针刀组与电针组两组间无差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组治疗前后旋转行为测定结果比较(±s)

表1 各组治疗前后旋转行为测定结果比较(±s)

注:与治疗前比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;与模型组比较，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;与电针组比较，##P＜0.01，#P＜0.05

组别 例数 平均转数(r/min)治疗前 治疗后空白组 8 0 0▲▲##模型组 8 11.50±2.33 12.50±2.07#电针组 8 10.88±3.09 8.25±2.37＊▲针刀组 8 11.00±3.20 7.50±2.20＊＊▲▲

2.2 光镜观察

中脑黑质HE染色结果显示空白组神经元细胞数目多，分布密集，排列有序，细胞形态正常，未见变性坏死，神经纤维排列整齐。模型组大鼠神经元细胞数目明显减少，排列紊乱;部分细胞肿胀或细胞固缩，可见空泡变性和凋亡细胞，伴小胶质细胞增生，少量间质细胞浸润;细胞核形态不一，体积增大，偏居一侧，核仁不明显;神经纤维排列紊乱，结构疏松。干预后，针刀组神经细胞数目明显增加，形态结构似正常，细胞肿胀减轻，小胶质细胞增生较少，神经纤维排列较整齐;电针组神经细胞数目有所增加，细胞肿胀减轻，伴小胶质细胞增生，神经纤维排列稍紊乱，且电针组与针刀组差异不明显。见封三彩图1。

2.3 大鼠黑质GSH含量水平变化

与空白组相比，模型组中脑黑质GSH含量明显降低，具有显著性差异(P＜0.01)。针刀和电针干预后，针刀组和电针组GSH含量明显升高，针刀组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)，电针组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)，针刀组与电针组相比无差异(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠黑质GSH含量水平测定结果(±s)

表2 各组大鼠黑质GSH含量水平测定结果(±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与电针组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n GSH(mg/L)空白组 8 5.19±1.94▲▲模型组 8 3.44±0.56＊＊#针刀组 8 4.65±0.83▲电针组 8 4.62±0.39▲

3 讨论

脑内有数个能神经通路，最主要的是黑质-纹状体系统。合成多巴胺的原料来自血液，黑质、纹状体区域经大脑中动脉，大脑中动脉则是颈内动脉直接的延续。中、老年人颈椎多有病变，颈部软组织损伤形成痉挛、瘢痕、粘连等可使神经、血管遭受牵拉或卡压，若刺激颈上交感神经节兴奋，会引起颈内动脉及其分支的血管平滑肌挛缩，进而血管管腔变小变窄，造成血流阻力增大从而影响大脑供血。临床观察发现无论PD患者或PD大鼠模型均伴有脑部血流量减少，基底节黑质-纹状体区系统尤为明显，血流量减少与临床症状波动有明显关系［12］。也就是说颈部软组织病变的因素可能直接或间接引起颈上交感神经兴奋，从而可能出现颈内动脉系统区域供血不足，从而多巴胺的合成原料不足［13］。因此本实验提出针刀松解颈部，减轻对颈上交感神经的刺激来治疗PD。

脑内耗氧量高且本身含有大量多聚不饱和脂质，极易发生过氧化反应而引起神经损伤。氧化应激在PD发生发展的作用得到越来越多的重视与关注［14］。神经毒素6-OHDA通过介导细胞内外的氧化反应引发黑质DA能神经元呈渐进行性不完全损害，较接近人类PD进行性变性特征。本实验采用单侧纹状体注射6-OHDA模型其诱发的旋转症状可以量化并且PD模型大鼠的旋转圈数常被用来反映大鼠黑质多巴胺(DA)能神经元受损程度。笔者实验发现行为学旋转实验中观察到空白组未见旋转行为，PD模型组出现旋转行为且干预治疗前后旋转圈数无差异(P＞0.05)，与空白组相比有显著差异(P＜0.01);同时中脑黑质HE染色发现模型组大鼠神经元细胞数目明显减少，排列紊乱;部分细胞肿胀或细胞固缩，伴小胶质细胞增生，说明6-OHDA引发了黑质多巴胺能神经元变性。针刀组和电针组干预治疗后大鼠活动有所增多，旋转圈数明显减少，治疗前后相比有明显差异(P＜0.05)，且HE染色观察干预后，针刀组神经细胞数目明显增加，神经元形态结构改善，细胞肿胀减轻，小胶质细胞增生较少;电针组神经细胞数目有所增加，神经元结构也改善。从行为学和病理组织学角度表明针刀可以改善PD模型大鼠APO诱发的旋转行为，增加神经细胞数目，改善神经细胞结构，黑质纹状体DA能神经元损伤程度有所减轻。

PD黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性坏死病理病因不明，目前众多观点认为可能与自由基、氧化反应增强、谷胱甘肽功能改变等因素有关［15］。GSH是中枢神经系统中非常重要的非酶性保护机制，作为细胞内一种重要的调节代谢剂和抗氧化剂，具有清除氧自由基、提高机体抗氧化防御能力等作用［16-17］。实验发现PD黑质部位GSH含量较对照组减少［18］，同时PD患者尸检报告黑质存在氧化应激及谷胱甘肽的耗竭［19］，同时PD黑质GSH含量降低是有疾病和部位选择性的，可能是PD发病的易感因素和最初的神经生化改变，GSH在PD的病理机制中起重要作用［20-22］。PD中GSH的大幅度降低会增加细胞组织对氧自由基的易感性，使神经元对于氧化破坏高度敏感［23-24］。总的GSH水平在PD中降低且GSH丢失程度与疾病严重程度相关［25］。越来越多的研究证实GSH与PD的发生、发展密切相关，研究发现GSH能减轻PD大鼠模型黑质区氧化应激损伤，对残存多巴胺能神经元有保护作用以及改善早期PD患者的病情等［26-27］，说明提高GSH在脑内的浓度或应用谷胱甘肽的类似物、前体可能是防治 PD及其它神经退行性疾病的有效途径［28］。笔者实验发现PD模型组大鼠GSH含量明显下降，与空白组相比具有显著性差异(P＜0.01);针刀和电针干预后，针刀组和电针组中脑黑质GSH含量明显升高，针刀组、电针组与模型组相比具有统计学差异(P＜0.05)，针刀组与电针组两组间比较无差异(P＞0.05)。由于GSH具有清除自由基的作用，对多巴胺能神经元具有保护作用。说明针刀和电针可能通过提升黑质GSH含量而增强清除自由基的能力，提高一定的抗氧化能力，从而起到减轻黑质DA神经元损伤的作用而延缓PD的发展。

针刀疗法是新的医疗过程，创造性的结合中医和现代西方医学，近年来常被运用于帕金森病的治疗，疗效值得肯定。本实验以针刀对颈枕部肌群软组织松解为切入点，针刀干预可改善PD模型大鼠的旋转行为、提升非酶氧化指标GSH含量。针刀治疗PD亟待多角度进行探讨，针刀治疗PD可能是复合多靶点效应，本实验针刀通过对颈枕部肌群软组织的松解从而提升抗氧化能力、减轻DA神经元损伤，可能是针刀治疗PD模型大鼠的机制之一。

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Effect of Acupotomy on the Ethology Changes and GSH Content of PD Model Rats

LIANG Jing-rong，GUO Chang-qing△，LU Juan，DU Ning-yu，MA Wei-wei，PIAO Qi-fan，WU Tong，XU Jing，ZHAO Rui-li，MA Tian，CHEN Chen，AN Na，LU Sheng-chun
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100029，China)

Objective:To observe the effect of acupotomy on the changes of ethology and glutathione(GSH) contents of substantia nigra in model rats with Parkinson＇s disease.Methods:Healthy male SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，an electroacupuncture(EA)group and an acupotomy group，with sixteen rats in each group.PD rat models were set up by unilateral striatum injection of 6-OHDA with two targets.Rats in EA group were treated by EA at“Baihui”(GV 20)and“Taiyang”(EX-HN5).Acupotomy group chose midpoint of the occipital bone inferior nuchal line and transverses process posterior tubercle C1 and C2 to debond and release.After treatment，rats were tested for rotational behavior and assessed the GSH contentof midbrain substantia nigra.Results:The blank group had no rotation behavior，and the model group had no difference before and after intervention(P＞0.05).In acupotomy group rotations were decreased significantly after treatment compared with those before treatment(P＜0.01)，and EA group had a significant difference before and after treatment(P＜0.05).The comparison of GSH contents among each group showed that the GSH contents of model group were significantly decreased compared with those of the blank group(P＜0.01).GSH contents of acupotomy group and EA group were increased significantly after the intervention，and the acupotomy group was significantly different from model group(P＜0.05).Conclusion:Acupotomy can improve the rotational behavior of PD model rats and increase GSH contents，and it may be by improving the antioxidant capacity to reduce the damage of DA neurons in substantia nigra.

Acupotomy intervention;Parkinson＇s disease;Oxidative stress;Glutathione

R246.6

A

1005-0779(2017)03-0061-04

2016-09-28

江西德兴市胜春医院课题，编号:535104032。

梁靖蓉(1989-)，女，2014级针灸推拿专业硕士研究生。

△通讯作者:郭长青(1959-)，男，教授，博士研究生导师，研究方向:针刀理论与临床研究。