基于中药药效物质“敲出/敲入”辨识模式筛选植物化感物质的思考

傅靖+张宝+刘红燕+李明杰+古力+李娟+王丰青+张重义

[摘要] 该文阐述了植物化感作用的概念、特征及其与其连作障碍危害形成间的关系，并结合课题组前期的研究成果，指出精准鉴别化感物质并验证其生态功能是破解植物连作障碍问题的关键。同时，针对化感物质分离鉴定中的难题，借鉴中药药效物质的研究方法，运用目标成分“敲出/敲入”的中药药效物质辨识与质量控制模式，提出了分离鉴定植物化感物质（群）的新思路和新方法。旨在为深化植物化感作用研究和消减中药材生产中连作障碍问题提供理论依据和技术支撑。

[关键词] 中药材； 连作障碍； 化感物质筛选； 药效辨识模式

[Abstract] This paper clarified in detail the definition， characteristics of allelopathy and its association with consecutive monoculture problem.Most of studies have indicated that it is critical to parse the formation mechanisms of consecutive monoculture problem that identification of allelochemicals and verification of its function. Here， we proposed a new approach to separate and identify the allelochemical group precisely and effectively， in which the "knock-out/in" methods of targeting ingredients in the model of medicinal effect identification and quality control were applied. This method will contribute to deep understanding plant allelopathy， and provide theoretical basis and technical support for alleviating consecutive monoculture problems simultaneously.

[Key words] Chinese medicinal material； consecutive monoculture problem； screening of allelochemicals； identification model of target components

化感作用（allelopathy）源于希臘语“Allelon（相互）和“elona（忍受痛苦）”。1984年Rice[1]在《Allelopathy》第2版中对其概念进行了补充和完善，化感作用即植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物的有利或不利的作用，而对应的代谢分泌物我们称之为化感物质，化感作用正是通过化感物质的化学生态学行为而呈现出来的。众所周知，探讨环境与生物之间的相互作用是生态学研究的核心，更是化学生态学研究的热点问题，旨在揭示化学物质在有机体种内或种间以及与环境之间的媒介作用及其作用规律。因此，对化感物质的认识及研究有助于阐明生物体与周围复杂环境（尤其是生物环境）之间的深层关系。但是由于化感物质的交互作用、剂量效应等，使得化感物质的分离和鉴定成为研究化感作用无法回避的科学问题[2]。本文提出了基于目标成分“敲出”的药效辨识模式的方法用以筛选植物化感物质，为探明化感物质在植物有机体种内或种间的媒介作用奠定基础并提供科学依据。

1 化感物质筛选是破解中药材生产中连作障碍难题的关键

1.1 中药材生产中连作障碍的现状 连作障碍（consecutive monoculture problem）或称重茬问题（replant problem & replant disease），是指在正常的管理措施下，同一块地连续多年种植相同作物造成作物产量降低、品质变劣、生育状况变差、病虫害频发的现象[3]。这一问题广泛存在于农业生产中，而中药材生产中表现尤为突出。据统计约占70%以上的根部（或根）入药的药用植物都存在不同程度的连作障碍，如连作地黄表现为植株生长不良，块根不能正常膨大，产量和品质明显下降，甚至绝收，而且每茬收获后须隔8～10年后方可再种[3]，人参、西洋参、三七和当归等连作障碍问题同样突出[4-6]。 因此，连作障碍问题研究业已成为当今中药农业可持续发展的战略性课题，也是当前药用植物资源生态学亟待解决的重要内容，成为国内外同行研究的热点[7，11-13]。

1.2 化感物质的介导是药用植物连作障碍形成的主要原因 前期研究表明，中药材生产中的连作障碍问题其成因极其复杂，它涉及土壤理化性质改变、植物体养分吸收受阻、根际微生物群落结构失衡以及植物化感毒害作用等多个方面[7-10]。总之，连作条件下各因素间协同互作造成的根际微生态环境恶化是植物连作障碍形成的重要原因。而越来越多的研究提示化感物质可能是造成植物毒害及土壤微生态环境恶化的“元凶”[14-22]。

化感物质（allelochemicals）是指植物所产生的影响其他生物生长、行为和种群生物学的化学物质，不仅包括植物间的化学作用物，也包括植物和动物间的化学作用物[23]。它主要通过植物地上部分的淋洗和挥发、根的分泌以及植物残体的分解等途径向生态系统中释放，从而影响周围或后茬植物的生长发育[24]。目前，已在地黄、丹参、人参等药用植物的组织和根系分泌物中分离出苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸等10多种化感自毒物质，这些物质通过影响离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和DNA合成以及基因的表达与调控等多种途径来影响植物生长[6-7，15]。

化感物质不仅对其他植物甚至自身产生毒害作用，还很容易扩散到环境中，改变根际土壤理化性质，进而影响土壤环境的微生态结构。以往对人参、西洋参、地黄、当归、三七等忌连作药用植物的研究表明，植物残茬或根系分泌物均具有不同程度的化感自毒作用，这些化感物质或直接对后茬植物产生影响，或通过破坏土壤中的微生物群落结构引起植物根际微生态环境恶化[16-18]。本课题组前期研究证实，太子参连作障碍的发生与化感物质介导下根际微生态环境恶化相关[19]。事实上，形成药用植物连作障碍的因素间还存在协同作用，且土壤微生物与化感作用物质间存在着拮抗和促进作用均已被证实，有些微生物能通过改变化感作用物质的数量和种类来影响化感作用，反之，化感物质也同样能改变土壤微生物区系[15，20-23]。本课题组前期研究结果也显示太子参连作后土壤酸化、pH降低，速效氮、钾、磷含量降低，微量元素缺失，根际土壤真菌、放线菌、厌气性纤维素分解菌等致病菌数量增加，细菌和好气性自生固氮菌显著下降[19]，最终导致土壤微生态环境恶化，引起太子参抗性降低、病变、畸形等症状。因此，精确鉴别植物化感物质，深入研究化感作用，详细解读化感物质介导根际微环境恶化的深层机制，对于揭示连作模式下植物-土壤-微生物系统复杂的生理生化过程，消减中药材和其他作物的连作障碍问题具有重要指导意义。

1.3 植物化感物质的分离鉴定成为揭示其连作障碍成因的技术难点 对化感物质进行提取分离及鉴定是正确、全面认识化感现象的前提，亦是解读连作障碍成因，消减连作障碍问题的关键所在。基于化感物质作用的多种途径，常采用夹层、常温吸附、浸提或腐解和疏水性根渗出液连续收集等方法进行提取，后用萃取、树脂和色谱等方法对其进一步分离纯化[25]。现代化学分析技术的进步为化感物质的分离鉴定提供了强有力的技术支持，利用气相色谱（GC）技术、高效液相色谱（HPLC）技术和气相-质谱联用（GC-MS）、液相-质谱联用（HPLC-MS）技术研究化感物质取得了很大的进展，尤其是液质联用与气质联用两种技术已成鉴定化感物质的主要方法。游佩进[26]采用HPLC-MS从连作三七土壤醇提液乙酸乙酯萃取层中鉴定出三七皂苷-G，同时他还利用 HPLC指纹图谱比对法从三七根区土壤和根中鉴定出一个共有化合物人参皂苷-Rh1。但由于液质联用没有专业的图谱库，分析比较困难，气质联用是目前公认的鉴定能力较强的方法之一[27]。张新慧等[8]采用GC-MS技术从当归根际土壤中获得了包括有机酸、酮、醛、酯和烃类等在内的17种化感物质。宋宇加[28]采用GC-MS对种植人参后土壤3种不同极性有机溶剂提取液进行测试，结果发现，辛酸是人参产生的重要化感成分之一；2-甲基戊醛、2-甲基-己烯醛、7-十六烯醛、8-十五酮和十三碳酸甲酯有可能是人参所特有的化感物质，但尚未进一步被辨识和筛选。然而，GC-MS技术只能分析热稳定且能气化的20%左右的有机物，使得其在化感物质分离分析中的应用大大受限[29]。

目前，化感物質的研究多为从植物中分离到的单体或几种成分的组合在较高浓度下对受试植物的生物测试。这种评价方法不能反应出自然界的真实情况，难以客观体现植物化感作用是多种化感物质多途径、协同作用的特点。由此，我们认识到探讨一条既快又准锁定发挥化感作用的主要物质，又能辨识化感物质互作关系的新途径，进而筛选出目标关键物，已成为解读连作障碍成因的关键环节和突破点。

2 目标成分“敲出/敲入”的药效辨识模式研究的启示

2.1 目标成分“敲出/敲入”的药效辨识模式的提出 基于目标成分“敲出/敲入”的中药药效物质辨识与质量控制模式，借鉴“基因诊断治疗”策略，强调中药的整体性，以中药“谱-效”关系为切入点，提出和论证基于目标成分敲出/敲入的中药“谱-效”关系与“量效”关系研究模式，以目标成分“敲出”研究辨析中药关键药效组分及其相互作用关系，可实现质控指标“找得准，测得准”，是药效物质识别与质量标准控制研究的新突破[30]。目前，已形成的较为成熟的敲出方法有薄层色谱法、液相色谱法、凝胶色谱法及超临界萃取法等[31-36]。Kong等[37]利用薄层色谱技术从牛黄中敲出了6种单一或混合组分，进一步抗菌实验研究表明6种组分间存在强烈拮抗作用，拮抗率达81.13%。李兴丰[32]、何静[36]对中药姜黄抗氧化药效物质识别与质量控制研究亦进一步证实“敲出”提取法是研究筛选中药药效成分的理想方法，验证了基于目标成分“敲出”策略进行中药关键药效物质辨识具有可行性。化感作用是多种化感物质共同作用于生物体的复杂体系，与复杂方药作用于人体的多靶点、多途径、多效应整合调控模式相吻合。因此，借鉴中药药效物质的研究方法，对植物化感物质（群）进行研究切实可行。

2.2 中药药效辨识模式研究与化感作用的物质基础研究具有相似性 迄今，对化感物质的研究或是从植物中得到混合物，但具体起作用的化学成分，尤其特有的化感物质尚不明确；或是以单个化感物质为研究对象，均忽视了化感物质间的相互作用。“组分中药”的提出，在一定程度上将中药多成分的复杂性问题简易化，为阐明植物化感自毒作用物质基础带来了契机[38]。在自然状态下，多种来源的化感物质间形成了复杂有序的互作关系，这与中药组分的理念相吻合。这里的“组分”是由一类理化性质和药理活性相似的成分按照一定比例，有机组合而成的具有完整结构和药理活性的单位，通过系统化的筛选方法，得到的可以表达中药整体的“中药组分”[39-40]。当然，中药组分理论的发展也有其相应的标准和范式，首先它应该基于中药整体性之上，其药效物质基础具有一定可识别性。其次，中药组分在组分间存在着复杂的配伍配比关系。最后中药组分应是具有完整结构和药理活性的单元。而基于目标成分的“敲出/敲入”策略恰恰吻合了方药作用的整体性，其目标成分的“谱-效”关系研究始终围绕方药整体性开展，“敲出”的目标成分是具有完整结构和药理活性的单元，体现了中医药整体观、系统观的特点和优势。植物化感物质“组分”应是具有一定结构的内在有序整体，其研究思路主要是通过结合自毒试验，筛选出合理的内部组分比，进而确定其组分结构。因此，基于目标成分的“敲出”策略能恰到好处地阐明中药“组分”的物质基础，而将其用于药用植物化感自毒作用物质的识别与筛选是切实可行的。

2.3 目标成分“敲出/敲入”的药效辨识模式的研究应用于化感物质筛选切实可行 当前，在中药药效物质与质量控制标准等研究领域内基于成分敲出/敲入的中药药效物质辨识与质量控制模式已被广泛应用。例如，孔维军等[31]通过敲出策略，初步实现人工牛黄抗真菌关键药效物质的快速辨识；张甜甜[41]基于组分敲出/敲入的中药组分辨识模式，结合金银花临床主要功效选用生物热力学抗菌模型和抗肠道病毒EV71的细胞病变模型为筛选模型对金银花关键药效物质进行辨识，又快又准地确定金银花抗菌抗病毒关键药效组分——异绿原酸。

至今，连作障碍问题严重影响中药药效物质与质量控制标准，作物连作障碍的形成及加重的原因復杂多样，各因素之间相互关联、相互影响，是植物和土壤系统内多种因素相互综合作用的结果。目前的研究普遍认为土壤理化性质的改变、微生物种群的变化和植物化感自毒作用是导致药用植物连作效应的主要因素，其中对于化感物质的筛选是解除植物连作障碍的关键[42]。通过基于目标成分“敲出/敲入”的中药药效辨识模式研究方法，对植物化感物质进行筛选是借鉴基于成分敲出/敲入的中药药效物质辨识与质量控制模式而形成的一种新兴技术，能够为又快又准地锁定化感物质组分、寻找主成份提供具有前瞻性、创新性和实用性的研究思路和方法体系。

3 展望

借助于其他学科的新理论新技术，使研究不断深入并得以突破。基于此，明确植物化感自毒物质种类及互作关系是进一步揭示植物化感自毒物质的生物合成与释放途径、探讨环境因子对植物化感自毒作用影响的基础，同时也是探明植物连作障碍成因，解读其化感自毒作用机制的关键所在。而探明植物化感物质种类首先要搞清植物忌连作如此突出是否与其含有特殊的化感物质有关系。此外，这些化感物质中哪些起主要作用，哪些起辅助作用，以及他们的协同关系等均不清楚，因此明确其组成、互作方式、量效关系及化学生态学行为等，对于进一步研究连作介导的根际土壤环境灾变机制与控制新策略具有重要作用，对于进一步揭示生态环境中生物体种间及种内的复杂相互关系具有重大指导意义。

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