自发性高血压大鼠尿液氨基酸代谢谱改变及两色金鸡菊提取物调节作用初探

马晓丽+马丽娜+毛新民+张雨洁+兰怡

[摘要] 在確证自发性高血压大鼠（SHR）模型成功后比较其与正常大鼠（Wistar）尿液氨基酸代谢谱的差异， 在此基础上初步研究两色金鸡菊提取物对SHR 血压及氨基酸代谢谱的调节作用。选取经过适应性饲养后的适龄雄性SHR大鼠和同龄Wistar 大鼠测量大鼠收缩压（SBP），舒张压（DBP）， 同时收集大鼠尿液，运用AQC柱前衍生高效液相色谱（HPLC）-荧光法测定尿液中氨基酸代谢谱， 利用多元统计分析中的偏最小二乘方判别分析（PLS-DA）研究2组动物的氨基酸代谢差异物。将所有饲养的SHR大鼠随机分成5组， 即模型组，两色金鸡菊提取物高、中、低剂量组（3.2，1.6，0.8 g·kg-1），西药卡托普利组（4 mg·kg-1），连续灌胃给药4周后收集大鼠尿液，测定各组氨基酸代谢谱。药物干预4周后，与Wistar组相比， SHR组的氨基酸代谢谱中丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸对分组的贡献较大，均显著高于Wistar组；与SHR组相比，卡托普利组的苏氨酸、蛋氨酸较模型组显著降低（P<0.01）；新疆两色金鸡菊醇提物低、中、高剂量组氨基酸代谢均有不同程度改变，其中低剂量苏氨酸较模型组显著降低（P<0.01）；中剂量组的丝氨酸、苏氨酸较模型组降低（P<0.05），缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸显著降低（P<0.01）；大剂量组的苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸显著降低（P<0.01）。研究结果显示，中、高剂量提取物能明显改善氨基酸代谢异常，帮助进一步阐释两色金鸡菊的药性研究，为高血压病存在氨基酸代谢通路异常提供数据支持。

[关键词] 自发性高血压大鼠； 氨基酸代谢谱； 高效液相； 两色金鸡菊

[Abstract] To compare the amino acid metabolic profiling in urine of spontaneously hypertensive rats （SHR） and normal Wistar rats， and investigate the regulatory effect of extract from Coreopsis tinctoria on blood pressure and amino acid metabolic profiling in SHR. Right aged SHR and Wistar rats were housed to fit the new environment for 2 weeks. After that， their systolic pressure（SBP）， diastolic pressure（DBP） were measured and urine was collected. Amino acids profiles for SHR and Wistar rats were acquired by using AQC precolumn derivatization HPLC-fluorescence method， and then partial least squares discriminant analysis（PLS-DA） was applied to facilitate differentiation and determine metabolic differences between collected samples from two groups of rats. Consequently， 40 SHR were randomly divided into 5 groups： model group， high， middle， low dosage groups of C. tinctoria extract （3.2， 1.6，0.8 g·kg-1）， and captopril group （4 mg·kg-1）. They were treated for 4 weeks by ig administration， and then their urine samples were collected to determine the amino acid metabolic profiling in various groups. After treatment for 4 weeks， as compared with Wistar group， serine， alanine， tyrosine， and cystine in the amino acid metabolic profiling were significantly increased in SHR group. As compared with SHR model group， threonine and methionine were decreased significantly in captopril group （P<0.01）； amino acid metabolism was changed to different degrees in high， middle， and low dosage groups of C. tinctoria extract， and the threonine in low dose group was significantly decreased （P<0.01）； serine and threonine were decreased （P<0.05）， and valine， methionine and lysine were significantly decreased （P<0.01） in middle dose group； threonine， valine， methionine and lysine were significantly decreased in large dose group （P<0.01）. The results showed that middle and high doses of extract from C. tinctoria could significantly improve disturbance of amino acid metabolism， help to further clarify the drug property research of C. tinctoria， and provide data support for amino acid metabolic pathway abnormalities in hypertension patients.

[Key words] spontaneously hypertensive rats（SHRs）； amino acid profiling； HPLC； Coreopsis tinctoria

高血压是常见的心脑血管病，普遍认为它是不同原因和致病因素引起的复杂疾病，能诱发动脉粥样硬化、中风等临床表现，还可导致心、脑、肾等重要器官的损害[1]。自发性高血压大鼠（SHR）起初来自于血压正常的Wistar Kyoto鼠交配，幼鼠出世后第5周开始出现严重高血压并导致血管病变[2]。因其病程变化类似于人类原发性高血压，因此非常适合于SHR的药物干预实验研究[3]。

两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.，又称昆仑雪菊[4-5]，属菊科植物，是中国的特有植物，新疆维吾尔自治区以野生两色金鸡菊代茶饮，具有降血压、降血脂、降糖的功效[6-7]。有研究认为其效应机制可能与降低氧化应激，减少丙二醛（MDA），增加一氧化氮和減少血管紧张素（Ang-Ⅱ）有关[8-11]。 本课题组前期对自发性高血压大鼠的代谢组学研究表

明，大鼠体内部分氨基酸代谢产物和葡萄糖等能量代谢物质明显异于正常大鼠[12-14]。

本研究首次采用AQC柱前衍生高效液相色谱荧光法结合正交偏最小二乘法（PLS-DA），发现SHR与Wistar 2组氨基酸代谢谱存在明显差异，通过定量方法找出了标志性氨基酸代谢物；模型确证后对两色金鸡菊各给药组和卡托普利组的氨基酸代谢进行了综合评价，探讨金鸡菊提取物长期给药后高血压大鼠尿液氨基酸的变化情况。

1 材料

无创血压计（BP-98A，北京软隆生物技术有限公司）；大容量低温离心机（TDL-5M，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；低温离心机（KDC-2046，科大创新股份有限公司中佳分公司）；电子天平（中山市衡新电子有限公司）；分析天平（AB204-N，梅特勒-托勒德）；高效液相色谱仪，配有 2475荧光检测器（美国Waters e2695）；快速混匀器（SK-1，江苏金坛医药仪器厂）；溶剂过滤装置、pH计（Sartorius，PB-10）；水浴锅（DK-S22）；离心机（Multifuge X3R，Thermo）。

新疆两色金鸡菊醇提物按照专利工艺（专利号CN201210270799）进行提取并制备成冻干粉 （乌鲁木齐三高和药业有限公司提供）；卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号1211031）；氨基酸衍生试剂盒（AccQ·Fluor，美国Waters 公司），包括17种混合氨基酸对照品，2A和2B AQC粉末以及硼酸盐缓冲液；Milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水（Millipore USA LLC production）；冰醋酸，无水乙酸钠，甲醇和乙腈均为色谱纯。

40只自发性高血压大鼠（SHR，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司），8只Wistar大鼠[雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001]；饲养环境每天光照12 h，温度为（21±2） ℃，湿度为45%～55%。

2 方法

2.1 SHR模型

将11周龄的40只雄性SHR大鼠和8只同龄Wistar大鼠适应性喂养2周后，连续2 d测量大鼠血压， 选取6只SHR大鼠作为模型组，8只Wistar大鼠为空白组，同时收集2组大鼠尿液。

2.2 分组及给药

将40只SHR大鼠均衡随机分为5组，即模型组、西药卡托普利组（4 mg·kg-1）、两色金鸡菊醇提物低剂量组（0.8 g·kg-1）、中剂量组（1.6 g·kg-1）、高剂量组（3.2 g·kg-1），8只Wistar大鼠为空白组。大鼠用普通饲料喂养，自由饮水，按10 mL·kg-1灌胃容积每天灌喂1次，连续灌胃给药4周。

2.3 血压测定

平均每5 d以无创血压计测量1次血压。操作时，将大鼠装进保温套中加热5 min，连续测量5～6次，取其收缩压（SBP）平均值作为该大鼠的血压值。

2.4 尿液收集和处理

采用代谢笼收集造模成功后大鼠夜间12 h的尿液置于冰箱（-20 ℃）保存备用。处理前将尿液于室温下解冻溶解，12 000 r·min-1离心10 min，0.22 μm滤膜将上清液过滤，移入EP管。吸取滤液10 μL放入高效液相进样瓶中，分别加入AQC衍生试剂，涡旋1 min，水浴55 ℃，10 min后进行HPLC分析。

2.5 HPLC分析

采用Waters e2695操作系统；Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（大连伊力特）；流动相A：将称取的无水乙酸钠15.2 g加入1 850 mL水中溶解，用冰醋酸调pH为6.5，再加乙腈140 mL，流动相B：甲醇-乙腈-水20∶60∶20，梯度洗脱，0～5 min，0%～2% B，5～6 min，2%～6% B，6～15 min，6%～9% B，15～19 min，9%～21% B，19～32 min，21%～45% B，32～34 min，45%～55% B，34～38 min，55%～100% B，38～45 min，100%～0% B，流速1.0 mL·min-1；进样量5 μL；柱温37 ℃；荧光检测，激发波长 235 nm，发射波长395 nm。用0.45 μm滤膜将充分混匀后的溶液进行过滤，采用荧光检测器对尿液中游离氨基酸进行含量测定。

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线与定量下限 线性考察通过标准添加法。以添加的氨基酸峰面积为纵坐标，添加浓度为横坐标进行线性回归，各氨基酸峰面积和浓度的线性相关系数r为0.992 4～0.999 7。氨基酸的尿液定量限（LOQ）为0.001～0.087 mg·L-1。

2.6.2 方法的精密度、衍生稳定性及回收率测定 连续进样5次考察各氨基酸峰面积的精密度，各氨基酸峰面积的 RSD 均小于4.0%，满足复杂生物样品的氨基酸分析要求。衍生产物稳定性结果显示通过AQC衍生后12 h内氨基酸的峰面积RSD在5.0%以内，说明衍生化后的样品至少在12 h内稳定。回收率由添加的低、中、高3个浓度水平分别计算得到，本方法中氨基酸的回收率为85.40%～120.3%。

2.7 数据分析

统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，数据结果用±s来表示，组间比较采用方差分析。氨基酸代谢组的数据采用SIMCA-P 11软件（Umetrics，Ume，Sweden）进行PLS-DA分析。

3 结果

3.1 SHR大鼠SBP的变化

实验结果表明，SHR大鼠给药各组血压较模型组有明显下降，参考本课题组已发表文章[14]。

3.2 SHR 和Wistar大鼠的尿液氨基酸代谢谱比较

采用AQC柱前衍生HPLC法测定生物样本中游离氨基酸含量，结果见图1，40 min内各氨基酸对照品得到有效分离，衍生试剂峰对尿样中氨基酸的测定基本没有干扰，可以利用对照品对尿液中各氨基酸进行准确定量。将2组大鼠氨基酸代謝组学数据经分析可得出一个满意的模型，前2个主成分能解释84.3%数据，见图2。2组大鼠的数据集中分布于椭圆形散点图（95%置信区域）的2个区域，说明高血压大鼠在氨基酸代谢特征上与正常大鼠存在差异的变量化合物，见图3，SHR的氨基酸代谢谱中丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸等氨基酸类代谢物对分组的贡献较大，均显著高于Wistar组。

3.3 两色金鸡菊对SHR大鼠尿液氨基酸代谢产物的影响

将两色金鸡菊各给药组、卡托普利组与SHR 模型组大鼠的代谢数据经PLS-DA 模型分析，得到一张散点图，见图4，各组数据基本聚集在一起， 可见组内氨基酸代谢模式基本一致且具有各自聚类的趋势， SHR模型组与阳性药物卡托普利组以及两色金鸡菊给药组存在一定的代谢差异。两色金鸡菊各给药组中除了小剂量组分布较散乱外，中剂量到大剂量依次向正常组靠近，大剂量组最接近正常组的代谢模式，说明大剂量组对SHR大鼠体内氨基酸的调节作用效果最好，甚至优于阳性药卡托普利组，提示两色金鸡菊组对自发性高血压大鼠血压的调节作用可能还通过调节氨基酸代谢紊乱来实现，可以使失衡的代谢谱由疾病状态恢复到正常状态。

3.4 SHR大鼠及各给药组尿液氨基酸的含量变化

通过方差分析得出：与空白对照组相比，模型组大鼠尿液中丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸均显著升高（P<0.01），灌胃给药4周后，与模型组相比，卡托普利组的苏氨酸、蛋氨酸

4 讨论

本试验对SHR这种最能模拟人类高血压发生、发展过程的动物模型进行了氨基酸代谢谱测定分析。根据本组前期工作基础，肯定了各给药组对SHR大鼠血压有着显著降低作用的同时，应用代谢组学技术中的靶标分析技术即氨基酸谱来研究高血压大鼠氨基酸类代谢产物的变化，进一步阐释药物对高血压大鼠的血压调节作用及可能的多种作用机制。

实验数据分别经过多元统计分析处理和传统的单因素方差分析，从代谢靶标分析结果看：两色金鸡菊各给药组对SHR尿液氨基酸代谢具有一定调节作用，经过PLS-DA分析发现各给药组与卡托普利组的代谢谱各自聚类，且较模型组有了明显转归，体现了中药的多组分、多靶点效应，具有整体改善疾病内环境的作用。而单因素方差分析结果同样显示金鸡菊各给药组对尿液中氨基酸的显著改变，尤其中、高剂量组对多种氨基酸具有显著降低作用，趋向正常水平，与多元分析结果基本一致，以此推断氨基酸标志物作为后续研究的重点标点深入跟踪分析。

综上所述，本实验结果可以从整体水平反映疾病治疗过程中的氨基酸代谢变化，通过多元统计判别认为氨基酸代谢变化可与SHR大鼠在药物作用下发生的血压相关病理生理变化联系起来，有助于更全面的阐述药物的治疗效果及分析作用机制。本研究通过高效液相色谱技术观察SHR大鼠尿液中的代谢产物变化，进一步了解到两色金鸡菊降低SHR大鼠血压可能与氨基酸代谢有关。今后，还需要与蛋白组学等联合分析才能深入了解两色金鸡菊对高血压作用的详细机制。

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