紫苏叶挥发油化学型和组分影响因素探究Ⅰ——不同生长发育期

魏长玲+张琛武+郭宝林+李卫萍+高占祥+张芬+田景

[摘要] 该论文以普遍存在的PK型、PA型及稀有的PL型3種紫苏种质为研究对象。在紫苏生长的营养期、开花期、果熟期3个时期进行紫苏成熟叶样品采集，同时分为1 d之中早7点、午12点、晚18点3个时间点，对其挥发油进行了提取（水蒸汽蒸馏法）和GC-MS分析，3种化学型的样品挥发油得率在0.08%～0.96%，不同生长时期挥发油得率大致为营养期>开花期>落叶期，营养期挥发油得率：PA型>PK型>PL型。各化学型类别不受生长发育影响，表明遗传因素决定了化学型。PA和PK型的特征成分和主要成分相对含量都比较稳定，而PL型的特征成分随生长发育大幅度降低，组成中还存在大量各类成分代谢的上游化合物，表明该化学型可能具有原始性和多变性。PA型特征成分紫苏醛相对含量各个时期基本上从早到晚逐渐降低。PK型特征成分紫苏酮在营养期和开花期中午相对含量高于早晚样品，果熟期则相反。PL型特征成分紫苏烯相对含量在营养期和果熟期都是中午最高，开花期则是傍晚样品最高。综合挥发油得率和主要成分相对含量，PA型的最佳采收时间在营养期的早晨采收；PK型的最佳采收期在各期午前均可；PL型的最佳采收期在营养期的晚上采收最好。

[关键词] 紫苏； 挥发油； 紫苏醛型； 紫苏酮型； 紫苏烯型； 生长发育时期； 相对含量变化

[Abstract] This experiment researched on three kinds of Perilla frutescens including the widespread PK， PA and rare PL chemotype. The Perilla samples were the mature leaves collected in nutrition， flowering and frutescence three different phenological periods， and at 7 am， 12 pm and 6 pm three day time. The volatile oil was extracted by steam distillationand analyzed by GC-MS， as a result， the three chemotype samples′volatile oil yield was between 0.08% and 0.96%； volatile oil yield of different growth period was as follow： nutrition>flowering>fructescence， and the volatile oil yield of nutrition period： PA type>PK type>PL type. Each chemotype was not affected by the growth and development， indicating that the chemotype is determined by genetic factors. Characteristic and main components of PA and PK type are relatively stable， and the characteristic components of PL type are significantly decreased with the growth. There are still a large number of upstream metabolism components， and the chemical type may have their primitiveness and changeability. The relative content of perillaldehyde， characteristic components of PA type， is basically decreased from morning to night， in all the period. The relative content of perillaketone， characteristic components of PK type， in nutrition and flowering period， when samples were collected at 12 noon is relatively higher than that at 7 am and 6 pm， and contrary to samples collected in frutescence period. The relative content of perillene， characteristic components of PL type， in nutrition and frutescence period are highest at 12 noon， while in flowering period is highest at 6 pm. According to the volatile oil yield and relative content of maincomponents， the best harvest time of PA type is in the morning of the nutrition period； the best harvest time of PK type is in the morning of all the period； and the best harvest time of PL type is at dusk of the nutrition period.

[Key words] Perilla frutescens； volatile oil； perillaldehyde chemotype（PA）； perillaketone chemotype（PK）； perillene chemotype（PL）； phenological period； changes of relative content

紫蘇叶因存在不同的挥发油化学型从而导致药用时活性存在差异。本实验在前期对国内紫苏资源调查和化学型归类分析的基础上[1-2]，选择了国内资源中普遍存在的紫苏醛型（PA型）和紫苏酮型（PK型），以及《中国药典》藿香正气液项下的紫苏叶油标准中涉及的紫苏烯型（PL型）3种不同化学型的紫苏[3]，研究它们不同在生长发育期、一天不同时间段的叶中挥发油化学型和构成挥发油组分的变化，并探讨可能的规律。

1 材料

1.1 仪器和试剂 GC-MS（7890B-5977A）气相质谱联用仪器（Agilent安捷伦公司）；旋转蒸发仪（EYELA N-1100 上海爱朗仪器有限公司）；分析天平（FA2014N型，上海精密科学仪器有限公司）；循环式真空泵（CA-1111上海爱朗仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

蒸馏水，石油醚（分析纯，北京化工厂）；正己烷（色谱纯，fisher公司）无水乙醇（分析纯，北京化工厂）。

1.2 样品 3份不同挥发油化学型的紫苏种子均来自经调查后确定的栽培紫苏主产区：PK型种子来自甘肃省庆阳市，PA型和PL型种子均来自重庆市，收集于2015年3月，种植于中国医学科学院药用植物研究所栽培实验田。3份种子以其对应的化学型名称为编号。播种期5月8日，出苗期5月17日左右。3个生长时期采集成熟叶样品，①营养生长期（简称营养期）：营养生长旺盛时期，植株高度约达最终高度的2/3，PK型样品采集于7月23日，PA型和PL型样品采集于8月20日；②开花期：花序上半数以上花开放，PK型样品采集于9月15日，PA型和PL型样品采集于10月8日；③果熟期：果序上半数果实成熟，植株下部叶片开始发黄和脱落，PK型样品采集于10月8日，PA型和PL型样品采集于10月19日，每1个生长期，又分为早晨7时（简称早）、中午12时（简称午）和傍晚18时（简称晚）3个时间点取样。叶片均采集自植株中部的成熟叶片，每个样品约60个单株的混合，阴干，阴凉处存放。

2 方法

挥发油提取和GC-MS分析参见文献[2]。

3 结果和讨论

紫苏叶PA，PK，PL 3个化学型在营养期、开花期、果熟期3个时期挥发油得率及GC-MS分析结果分别见表1～3。

3.1 挥发油得率的变化 PA型各生长时期挥发油得率均表现为：生长发育期对挥发油得率影响很大，营养期开花期>果熟期；从1 d的不同时间点看，营养期：早中≈晚；而开花期和果熟期：早≈中>晚。

PK型各生长时期挥发油得率均表现为：营养期≈开花期>果熟期，下降幅度不大。从1 d的不同时间点看，营养期：早≈中>晚，而开花期和果熟期：早<中，中>晚，开花期早晚差不多，而果熟期的早晨挥发油很低0.08%，是较为特殊的结果。

PL型在各生长时期挥发油得率大体表现为：营养期>开花期≈果熟期，下降幅度不大。从1 d的不同时间点看，营养期：早>午晚，开花期：早≈午晚，果熟期：早≈午<晚，在2个发育期表现为晚上得率最高，是有意思的现象。

本结果支持紫苏叶采集时间一般应为营养期或花前期，而不应在果熟期采集，其中PA型对采集时期非常敏感，而PL型次之，PK型紫苏则营养期直至花期采集均可。在适合采集期里，PA型应该在早晨采集，PK型则从早到午采集均可，PL型却在傍晚采集最好。

3.2 挥发油组成变化 3种化学型样品，在各生长发育期的化学型类型是稳定的，且石竹烯（caryophyllene）为3个化学型各时期共有的较高含量成分，与以往关于PA型和PK型的报道一致[4-7]。

PA型挥发油组成可分为4个主要部分，第一部分是该化学型的特征成分紫苏醛（perillaldehyde）、D-柠檬烯（D-limonene），以及和该化学型代谢相关的几个单萜： trans-shisool、紫苏醇（perilla alcohol），紫苏醛的相对含量大多在50%左右，花期的相对含量稍高，D-柠檬烯是紫苏醛代谢直接上游化合物，在3个生长发育期大致是逐渐降低的趋势，其中在开花期和果熟期的傍晚都低于2%；其他几个成分中，紫苏醇和trans-shisool则在果熟期增加较多，如trans-shisool在其他时期1.45%～3.36%，果熟期则为3.84%～4.95%，紫苏醇在营养期未检测到，花期低于1%，到果熟期傍晚则达到8.14%；第二部分是倍半萜类成分，包括石竹烯、α-佛手柑油烯（α-bergamotene）、葎草烯（humulene）、大根香叶烯D（germacrene D）、γ-榄香烯（γ-elemene）、石竹烯氧化物

（caryphyllene oxide）和α-法尼烯（α-farnesene），石竹烯在全部样品中相对含量变化不大，15.61%～17.77%，α-佛手柑油烯在果熟期较其他时期相对含量高，其他几个成分大多是果熟期略有增加，α-法尼烯含量较低（0～1.11%）；第三部分为该化学型中一般不会出现的单萜成分，如PK型的紫苏酮（perillaketone）、PL型的紫苏烯（perillen）仅在开花期检出紫苏酮（开花期午1.05%，晚4.39%）和紫苏烯（开花期晚1.16%）；第四部分是芳香类化学型PP型的构成成分及相关成分，肉豆蔻醚（myristicin）及其上游代谢成分丁香酚（eugenol），肉豆蔻醚则在3个发育时期的9个时间点中6个时间点检出，且含量大小没有规律，如开花期仅在傍晚检出，而含量却最高（7.61%），丁香酚仅在开花期和果熟期的中午和傍晚检出。另有紫苏中所有单萜类成分代谢的共同上游成分芳樟醇（linalool），在各个时间点均有检出（0.72%～3.76%），相对含量大致呈现随发育期逐渐降低。

PK型挥发油组成可分为3个主要部分，第一部分是该化学型的特征成分紫苏酮（perillaketone），以及代谢相关的白苏烯酮（egomaketone），紫苏酮的相对含量在48%～70%，营养期（约50%）<开花期（约60%）<果熟期（67%以上），一天的不同时间点，则营养期和开花期是中午最高，果熟期反而是中午最低，白苏烯酮是紫苏酮代谢的前体化合物，相对含量正好与紫苏酮相反，且变化幅度比较大，营养期（36%以上）>开花期（大约22%）>果熟期（大约15%）；第二部分也是倍半萜类成分，包括与PA型共有的石竹烯、α-法尼烯、葎草烯、石竹烯氧化物，以及2-丁烯二环庚烷（2-（1-buten-3-yl）-bicyclo[2.2.1]heptane）和保留时间为11.01的未知成分（经GC/MS软电离分子量分析，为倍半萜成分），均相对含量变化不大。第三部分为该化学型中一般不会出现的单萜类，如PA型的D-柠檬烯，仅在开花期的中午检测出，微量（0.13%）。未检出芳香类化合物。另外上游单萜成分芳樟醇在开花期和果熟期检测到，相对量均小于1%。另有一种在植物挥发油中常存在的1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol），又叫蘑菇醇，在开花期和果熟期检出，相对量也均小于1%。

PL型挥发油组成可分为4个主要部分，第一部分是该化学型的特征成分紫苏烯，其含量在不同生长发育期表现为极大的差异，营养期（大于75%）>开花期（54.51%～60.70%）>果熟期（3.57%～24.36%）；第二个部分是倍半萜类成分，包括和PA， PK共有的石竹烯、α-佛手柑油烯、葎草烯、石竹烯氧化物、α-法尼烯，以及和PA共有的大根香叶烯D、还有反式橙花叔醇（trans-nerolidol），石竹烯、α-佛手柑油烯和大根香叶烯D在生长发育期均表现为营养期<开花期<果熟期，且变化幅度很大，如石竹烯从营养期的大约7.52%～9.31%变为果熟期的19.02%～25.71%，其他几种倍半萜或者在营养期、或者在花期未检出，或相对含量很低，而果期均相对含量均增加，且大多高于在PA和PK型中的同期情况；第三部分为其他化学型中的单萜成分，如紫苏醛、D-柠檬醛，紫苏酮，薄荷酮，均在部分时间点的样品中检出，含量不高，也未見明显规律；第四部分为芳香类化学型中的成分，如细辛脑（asarone）、丁香酚，且含量较高。在PL型中还发现紫苏单萜成分代谢过程中的多个上游化合物，除了芳樟醇，还有顺势牻牛儿醇（cis-geraniol）、顺式柠檬醛（cis-citral）、反式柠檬醛（trans-citral），均是在部分时间点检出。此外PL型中还检出了一些植物挥发油中常见成分，除了1-辛烯-3-醇，还有邻二甲苯（O-xylene）、甲基水杨酸（methyl-salicylate），也是在部分时间点检出。

Nitta等通过杂交实验推测了紫苏叶挥发油中主要化学型构成成分单萜类和芳香类两类成分的生物合成途径，单萜类以甲羟戊酸（mevalonic acid）途径合成，芳香类终产物以莽草酸（shikimic acid）途径合成，两途径之间因基因控制而发生切换[8]。从生源合成途径来看，本实验的3个化学型样品均以甲羟戊酸途径合成，但在PA型样品全生长期均检出芳香类成分肉豆蔻醚、开花期和果熟期检出芳香类成分的前体化合物丁香酚，PL型样品的全生长期均检出丁香酚、果熟期检出芳香类成分细辛脑，而PK型样品各时期均未检出芳香类成分，故作者认为对于PA型和PL型，单萜类和芳香类2个合成途径之间可能并非严格的单基因控制。紫苏烯是紫苏酮的前体化合物，但自然界PK型为最普遍的化学型，在已有报道的PK型紫苏挥发油中一般无紫苏烯成分或微量存在（0.8%）[9-12]，说明紫苏烯很容易转化为紫苏酮。PA型和PL型中均检出紫苏酮，而PK型中仅检出极微量的PA型特征成分D-柠檬烯，说明PK型较PA和PL型为优势（显性）化学型[10]，另外从种类和相对含量上，PK型中较少代谢上游单萜成分，而PA型较多、PL型更多，其他文献也支持这样的状况[13]，表明几种化学型中可能PL较为原始、PA适当进化，PK更为进化，本研究结果为进一步探讨紫苏单萜类成分的代谢控制，以及不同化学型之间的进化关系，有一些不错的提示[13]。

3.3 主要成分相对含量变化 本实验选择了每种化学型的相对含量在前5位的化合物，比较它们在不同发育期（早晨）相对含量的变化，结果参见图1。

PA型挥发油中主要成分单萜类的紫苏醛、D-柠檬烯和trans-shisool，以及倍半萜类的石竹烯、α-佛手柑油烯均表现为在不同发育期内相对含量的稳定性，表明单萜类的几种成分的转化不受生长发育影响。

PK型挥发油中主要成分单萜类的紫苏酮和白苏烯酮表现为随生长发育前者上升，后者下降的趋势，而二者之和相对稳定，而倍半萜类的石竹烯、α-法呢烯和石竹烯氧化物表现稳定，表明白苏烯酮转化为有条件转化，紫苏酮受生长发育较大影响。由于白苏烯酮存在于PK型紫苏中的情况较少，因此本实验样品表现出了一种特殊性，可作为一种特殊研究材料。

PL型挥发油中主要单萜成分紫苏烯，随生长发育呈现出相对含量大幅度减少的趋势。而倍半萜成分α-佛手柑油烯、石竹烯、大根香叶烯D不同于PA和PK型，相对含量均呈增加趋势。芳香类成分丁香酚相对含量也呈增加趋势。PL型中主要特征成分随生长发育的相对含量巨幅减少，而其他成分的相对含量增加，都表明PL型的化学构成的特殊性，这为阐明紫苏叶挥发成分的生物合成具有重要的价值。

4 小结

综合生长发育期和一天不同时间点的挥发油得率和挥发油中特征成分相对含量（得率×相对含量）的变化，PA的最佳采收时间在营养期的早晨采收；PK型的最佳采收期在开花期的中午，营养期和开花期的午前均可；PL型的最佳采收期在营养期的晚上采收最好。由于本项目设定的营养期为植株尚未长到最终高度的时期，且本论文各类型均只涉及一个实验样品，因此有必要对更多的紫苏种质进行营养期至开花期的主要特征成分含量变化的研究，以确定最佳的采收时间，以及适合的采收期范围。

各化学型类别不受生长发育影响，表明遗传因素决定了化学型。PA和PK型的特征成分和主要成分相对含量都比较稳定，而PL型的特征成分随生长发育大幅度降低，倍半萜类成分和芳香类成分的相对含量在生长发育期呈现较大变化，而且组成中还存在大量各类成分代谢的上游化合物，表明该化学型可能具有原始性和多变性。

一天之中，PA型特征成分紫苏醛相对含量各个时期基本上从早到晚逐渐降低，D-柠檬烯相对含量早晨较傍晚高。PK型特征成分紫苏酮在营养期和开花期中午相对含量高于早晚样品，果熟期则相反。PL型特征成分紫苏烯相对含量在营养期和果熟期都是中午最高，开花期则是傍晚样品最高。

挥发油中组分的含量无论是随生长发育还是一天的变化包括了合成、降解、转化和散发几个同时作用的过程，本研究通过对3个紫苏单萜类化学型组成变化的初步研究有助于找到一些特殊的类型和变化阶段，为后续深入的合成生物学研究奠定基础。

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