丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的制备及其体外抗肿瘤药效研究

陈晨+王慧洁+刘芙蓉+王银+毛声俊+金辉

[摘要] 采用高压均质法制备丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒，以粒径、包封率和载药量为评价指标，采用星点设计-效应面法优选处方，进而考察其体外抗肿瘤效果。结果表明，采用优选的处方制备的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒形态为规则的圆球形，粒径分布均匀，平均粒径为（175.7±3.07） nm，包封率和载药量分别为90.8%±1.47%和5.52%±0.09%。对于人早幼粒细胞白血病NB4细胞，载丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒较游离药物有更优的抑瘤效果。白蛋白纳米粒制备工艺简便，可显著改善丹参酮ⅡA的溶解度，有助于拓展其在抗血液肿瘤方面的应用。

[关键词] 丹参酮ⅡA；白蛋白纳米粒；处方优化；抗肿瘤

[Abstract] In this study， the tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles were prepared by high pressure homogenization method. The formulation was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM ）， with the particle size， encapsulation efficiency， and drug loading as indexes to investigate their in vitro anti-tumor effect. The results showed that the prepared nanoparticles had uniformly spherical morphology and uniform particle size distribution. The average particle size， encapsulation efficiency and drug loading of nanoparticles were about （175.7 ± 3.07） nm， 90.8%±1.47% and 5.52%±0.09%， respectively. Tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles showed a more powerful antitumor effect than free tanshinone ⅡA for human promyelocytic leukemia NB4 cells. The preparation method of the drug-loaded albumin nanoparticles was simple and easy， and can significantly improve the solubility of tanshinone ⅡA， so it was helpful to extend its application in therapies against hematological malignancies.

[Key words] tanshinone ⅡA； albumin nanoparticles； formulation optimization； anti-tumor effect

丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取的一种脂溶性成分，其在心脑血管疾病、抗菌消炎、抗氧化等方面具有确切药理作用[1]。研究发现，丹参酮ⅡA可抑制多种肿瘤细胞的生长，其对人早幼粒白血病细胞具有明显增殖抑制作用[2]。然而丹参酮ⅡA水溶性差（溶解度仅为2 mg·L-1），口服生物利用度低（<3.5%），半衰期短，渗透性差[3]，限制了其在臨床上的推广应用。白蛋白纳米粒是一种生物相容性优良的载体，其不仅能增大难溶性药物的溶解度，还可增强抗肿瘤药物的功效[4]。据此，考虑到丹参酮ⅡA与白蛋白结合率高（血浆蛋白结合率99.2%）的特点[3]，采用高压均质的方法[5]制备丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒，以期提高其溶解度，充分发挥其抗肿瘤作用。本研究以粒径、包封率和载药量的综合评分为评价指标，采用星点设计-效应面法优化丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的处方，并对其药剂学特性与细胞药效学进行初步考察，为拓展丹参酮ⅡA在抗血液肿瘤方面的应用提供新剂型和新思路。

1 材料

丹参酮ⅡA（纯度>95%，南京狄尔格医药科技有限公司，批号D20150622A）；丹参酮ⅡA对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-15021504）；牛血清白蛋白（美国Amresco，纯度>98%）；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Amresco公司；胆固醇（上海惠世生化试剂有限公司，批号151024）；精制蛋黄卵磷脂（德国Lipoid，批号510300-2153731/948）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

高效液相色谱仪 Agilent 1100（美国安捷伦科技有限公司）；ALC-110.4型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；UV-2450紫外分光光度计（SHIMADZU 日本岛津公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析仪（英国Malvern）；拓普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；EF-C5 高压均质机（加拿大Avestin公司）；HENC高速剪切仪（德尔特混合设备有限公司）；冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的制备

称取200 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于20 mL超纯水中，超声溶解，作为水相；另称取20 mg丹参酮ⅡA 、40 mg胆固醇、40 mg蛋黄卵磷脂溶于0.9 mL的氯仿中，超声溶解，作为油相。在高速剪切仪的作用下，将油相缓慢地注入水相中，高速剪切8 min，制备得到粗乳，迅速将粗乳转移至高压均质机中，均质10次，在35 ℃下，减压真空除去氯仿，最终得到白蛋白纳米粒胶体溶液[6]。

2.2 丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的药剂学特性表征

2.2.1 形态学观察 取适量丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒溶液，加水稀释后，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用20 g·L-1磷钨酸负染样品后，自然晾干后于透射电镜下观察，结果见图1。由图1可见，纳米粒形态较为圆整，粒径较均匀。

2.2.2 粒径分布与Zeta电位 采用激光粒度分析仪对所制备的白蛋白纳米粒的粒径、分散系数（PDI）及Zeta电位进行测定，其平均粒径为（175.7±3.07） nm，PDI为（0.187±0.04），Zeta电位为（-22.2±0.62） mV（n=3）。

2.3 包封率和载药量的测定

2.3.1 色谱条件[7] 色谱柱Cosmonsil C18 烷基硅胶键合相（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（75∶25）；柱温25 ℃；检测波长270 nm；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长270 nm。方法的专属性良好；回归方程为Y=118.82X+69.15，r=0.999 9。丹参酮ⅡA在16～80 mg ·L-1与对应的色谱峰面积线性关系良好；精密度和重复性RSD分别为0.78%，0.67%；平均加样回收率为99.7%，RSD为1.2%。

2.3.2 白蛋白纳米粒样品的处理 精密量取按2.1项下制得的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒1.0 mL于5 mL量瓶中，加入0.5 mL 0.01 mol·L-1盐酸，用无水乙醇定容，摇匀，超声5 min，0.22 μm微孔滤膜精滤，按2.3.1项下色谱条件测定峰面积，计算。

2.3.3 包封率和载药量的测定 参考文献[8]方法，取200 μL的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒注入G25葡聚糖凝胶柱，用超纯水洗脱，待棕红色纳米粒洗脱至凝胶柱底端时，用离心管接收白蛋白纳米粒洗脱液，直至其完全被洗脱（约5 mL）。将上述纳米粒洗脱液按2.3.2项下方法处理，进样HPLC检测，即可测得被包封的药物量We，另取同等体积未过柱分离的白蛋白纳米粒，稀释至与总洗脱液相同的体积，再取稀释后的纳米粒按2.3.2项下方法处理，同法操作，即可得白蛋白纳米粒中药物总量Wt。将纳米粒在制备时的投药量记为Wa，血清白蛋白及药用辅料的总量为Wd。包封率（EE）公式为EE=（We/Wt）×100%；载药量（DLE）公式为DLE=（Wa×EE）/（Wa+Wd）×100%。

2.4 溶解度的测定

在2.1项下制备的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒中加入3%的甘露醇，溶解后，转移至-80 ℃冰箱冷冻24 h，然后迅速转移至冷冻干燥机中冻干36 h，得到纳米粒冻干粉。将过量的丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒冻干粉加入到5 mL水中，平行操作3次，超声后，于（37± 0.5） ℃恒温振摇24 h，平衡后，4 000 r·min-1离心10 min[9]。取上清液0.5 mL，按2.3.2项下方法，提取丹参酮ⅡA，进样测定。根据实验结果得出丹参酮ⅡA及其白蛋白纳米粒制剂在水中的溶解度分别为（2.31±0.03），（708±1.15） mg·L-1（n=3）。

2.5 制剂处方优化

2.5.1 星点设计-效应面法优化处方[10] 参考预实验中的单因素试验结果，将剪切时间设为8 min，均质次数设为10次，有机相体积设为0.9 mL，附加剂（胆固醇和蛋黄卵磷脂）的比例设为1∶1，采用星点设计-效应面法考察牛血清白蛋白质量（A）、附加剂质量（B）和丹参酮ⅡA质量（C）对载药白蛋白纳米粒粒径（Y1）、包封率（Y2）及载药量（Y3）的影響。使用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对3因素分别设定5水平，各因素水平见表1。以Y1，Y2和Y3共同作为评价指标，每个指标均标准化为“0～1”之间的“归一值（desirability，di）”。公式为OD=（d1d2……dk）1/k ，k为指标数。其中，对于取值越大越好的指标（如包封率、载药量）和取值越来越小的指标（如粒径）分别按公式dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）和dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）计算各指标的di[11]。实验安排及结果见表2。

2.5.2 模型拟合与方差分析 使用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对上表数据进行二次多项式拟合，拟合方程为Y1=467.063 91-0.622 64A-2.743 66B-11.550 99C-0.003 012 5AB+0.015 35AC-方差分析结果显示，该二项式拟合模型F为4.37，P<0.05，是一个显著的模型，对响应值OD影响显著的顺序依次为B>C>A，交互项AB，AC和BC对指标的影响均不显著，二次项A2影响不显著，而二项式B2和C2影响显著，由此可说明各因素间的交互作用较小。该二次项拟合模型拟合效果良好，且具有显著性，可作为丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒处方优化预测模型。

2.5.3 等高线图及效应面图综合分析 固定牛血清白蛋白质量、附加剂质量、药物质量3个因素中任意一个，考查其他2因素交互作用对OD值的影响，结果见图2。由图可知，在3个因素中，对于OD影响最大的是附加剂的质量，其次是药物质量，而白蛋白质量的影响相对很小。在一定范围内，随着附加剂质量的增加，OD呈非线性减小趋势，表现为曲面较陡；而随着白蛋白质量的增加，OD呈线性增加趋势，表现为曲面较平滑。

根据Design-Expert.V 8.0.6.1软件对试验结果进行系统分析，得出在拟定工艺条件下的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的最佳处方：牛血清白蛋白200 mg、附加剂的质量80 mg、丹参酮ⅡA质量20 mg。预测在此处方条件下制备的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的粒径为173.3 nm，包封率为90.1%，载药量为5.48%，OD为0.869。

2.5.4 處方验证[12] 按照以上优化处方平行制备3批样品，结果见表4。由表4可见，实际所得白蛋白纳米粒的粒径与预测值相差（二者之差除以预测值）1.37%，包封率与预测值相差0.75%，载药量与预测值相差0.73%。结果表明，该模型可以准确的预测白蛋白纳米粒的质量特性参数。另制剂学特性表征均按照最优处方进行测定。

2.6 体外抗肿瘤活性评价

2.6.1 白蛋白纳米粒的细胞毒性 参考文献[13]方法，选择对数生长期的人早幼粒细胞白血病NB4细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，取100 μL的细胞悬液接种于96孔板，在96孔板外围孔中，分别加入100 μL细胞培养基以避免边缘效应，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养12 h过夜。每孔加入经RPMI 1640培养基稀释的空白载体溶液（白蛋白浓度依次为200，100，50，25，5 mg·L-1，每个浓度设置3个复孔）40 μL，同时设置不加载体的对照组（含细胞）及调零孔（不含细胞），然后置孵箱中培养48 h。实验结束前4 h，每孔加入MTT液（5 g·L-1）20 μL，37 ℃培养4 h，每孔加入100 μL SDS，放置过夜后，置酶联免疫检测仪于570 nm测定各孔的吸光度（A），按公式“细胞存活率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%”计算细胞存活率。结果为经不同浓度白蛋白纳米粒处理的细胞，其存活率为90%±0.84%（n=3），表明空白纳米粒对细胞几乎无毒性。

2.6.2 载药纳米粒的抗肿瘤作用 细胞铺板同2.5.1项。用培养基将载药白蛋白纳米粒稀释至50，25，12.5，6.25，3.12 mg·L-1（每个浓度设置3个复孔）加入96孔板中，后续操作同2.5.1项。同时用培养基将丹参酮ⅡA储备液稀释至与载药白蛋白纳米粒相同浓度作为对照考察，结果见图3。游离丹参酮ⅡA和载丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒对NB4细胞的杀伤作用均具有浓度依赖性，且载药白蛋白纳米粒的细胞毒性显著强于游离丹参酮ⅡA，IC50分别为（10.43±0.12），（5.69±0.04） mg·L-1（n=3）。

3 讨论

血清白蛋白是一种安全、无毒、生物相容、可降解的广泛存在于血液中的蛋白质，这些特性使其成为一种良好的载体材料[14]。目前制备白蛋白纳米粒的方法主要有超声乳化法、去溶剂化法以及蛋白结合技术。其中去溶剂化法是制备白蛋白纳米粒常用的方法，但作者在预实验中发现，丹参酮ⅡA在无水乙醇中溶解度差，无法形成载药纳米粒，故采用蛋白结合技术制备丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒。蛋白结合技术指的是在高速剪切力作用下，载药的有机溶剂以纳米液滴的形式分布于白蛋白水溶液中，在均质过程中产生的空穴和热效应，会引起血清白蛋白的二硫键桥联而形成纳米粒[15]。与去溶剂化法制备的白蛋白纳米粒相比，其制备工艺简单，包封率和载药量较高，可实现规模化生产。另在预实验中发现，加入一定量的蛋黄卵磷脂和胆固醇可显著降低纳米粒的粒径，这可能是由于它们的存在提供了亲脂性的微环境，增加了难溶性药物丹参酮ⅡA与白蛋白的结合作用[16]。由溶解度测定结果可知丹参酮ⅡA在水中的溶解度为2.31 mg·L-1，而以白蛋白纳米粒的制剂形式其溶解度可达到708 mg·L-1，与其水溶性相比提高了近300倍，较好地解决了丹参酮ⅡA的难溶性问题。在体外细胞实验中，载丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒较游离药物表现出更优的抑瘤效果，这可能是由于白蛋白纳米粒提高了丹参酮ⅡA的溶解度以及肿瘤细胞对白蛋白纳米粒具有较强的摄取能力，从而增加了丹参酮ⅡA在肿瘤细胞内的聚集，发挥药物的抗肿瘤功效[17]。

综上，本研究采用高压均质法制备得到的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒，不仅提高了其溶解度，还增强了其抗肿瘤药效，将有助于拓展丹参酮ⅡA在抗血液肿瘤方面的应用。

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