乳香没药挥发油对川芎体外透皮吸收的影响及其皮肤血流促透机制研究

朱小芳+罗晶+管咏梅+余雅婷+金晨+朱卫丰+刘红宁

[摘要] 該文拟探索乳香、没药挥发油对川芎体外透皮吸收的影响，并从皮肤血流变化角度探讨乳香、没药挥发油可能的促透机制。通过改良的Franz扩散池和离体的小鼠皮进行体外透皮实验，HPLC测定川芎阿魏酸的累积透过量，考察乳香、没药挥发油对川芎透皮特性的影响，同时，采用激光多普勒法测定皮肤血流量。研究结果显示，川芎阿魏酸24 h的累积透皮量为（8.13±0.76） μg·cm-2，氮酮组、乳香组、没药组、乳没单提混合组、乳没混合提取组分别为（48.91±4.87），（57.80±2.86），（63.34±4.56），（54.17±4.40），（62.52±7.79） μg·cm-2，各组挥发油的增透倍数分别为7.68，8.26，7.26，8.28，均大于氮酮组的6.55。而且，乳香组、没药组、乳没单提混合组及乳没混合提取组大鼠分别在涂药10，20，30，10 min时，血流量相比涂药前有显著性差异，有明显的增加趋势，表明乳香、没药挥发油可在一定程度上增加皮肤血流量。可知，乳香、没药挥发油配伍前后对川芎均有一定的促透作用，且可能通过增加皮肤血流量，促进药物从皮肤表皮到真皮层毛细血管的消除，从而实现促透。

[关键词] 川芎； 乳香没药； 挥发油； 透皮吸收； 皮肤血流； 促透机制

[Abstract] The aim of this paper was to explore the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal absorption in vitro of Chuanxiong， and to investigate the possible penetration mechanism of their essential oil from the perspective of skin blood perfusion changes. Transdermal tests were performed in vitro with excised mice skin by improved Franz diffusion cells. The cumulative penetration amounts of ferulic acid in Chuanxiong were determined by HPLC to investigate the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal permeation properties of Chuanxiong. Simultaneously， the skin blood flows were determined by laser flow doppler. The results showed that the cumulative penetration amount of ferulic acid in Chuanxiong was （8.13±0.76） μg·cm-2 in 24 h， and was （48.91±4.87）， （57.80±2.86）， （63.34±4.56）， （54.17±4.40）， （62.52±7.79） μg·cm-2 respectively in Azone group， Frankincense essential oil group， Myrrh essential oil， frankincense and myrrh singly extracted essential oil mixture group， and frankincense and myrrh mixed extraction essential oil group. The enhancement ratios of each essential oil groups were 7.68， 8.26， 7.26， 8.28， which were slightly greater than 6.55 in Azone group. In addition， as compared with the conditions before treatment， there were significant differences and obvious increasing trend in blood flow of rats in Frankincense essential oil group， Myrrh essential oil group， frankincense and myrrh singly extracted essential oil mixture group， and frankincense and myrrh mixed extraction essential oil group when were dosed at 10， 20， 30， 10 min respectively， indicating that the skin blood flows were increased under the effects of Frankincense and Myrrh essential oil to a certain extent. Thus， Frankincense and Myrrh essential oil had certain effect on promoting permeability of Chuanxiong both before and after drug combination， and may promote the elimination of drugs from epidermis to dermal capillaries through increase of skin blood flow， thus enhancing the transdermal permeation amounts of drugs.

[Key words] Chuanxiong； Frankincense and Myrrh； essential oil； transdermal absorption； skin blood flow； penetration mechanism

中药经皮给药可发挥局部或全身治疗作用，早在汉代《五十二病方》中，就有“药浴法”治疗小儿“子癫”的记载，清代外治专著《理瀹骈文》几乎把一切见闻的病都用膏药治疗，表明中药经皮给药运用的悠久历史与重要地位[1]。现代研究发现应用透皮吸收促进剂可改善药物透皮吸收，且中药挥发油大多具有良好的透皮吸收促进效果。改变皮肤角质层结构组成是目前公认的中药挥发油皮肤促透机制[2-3]，也有研究者认为可通过促进皮肤血流来实现促透效果[4]。

川芎味辛、性温，具“活血行气，祛风止痛”功效，阿魏酸是其中一个主要有效成分，具抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、抗肿瘤等多种药理活性，其pH稳定性好、相对分子质量小、亲脂性强、透皮渗透性能好，医药、保健品、化妆品等行业有较高的应用价值[5]。川芎以经皮给药系统给药可避免口服的肝脏“首过效应”，并可维持稳定而持久的血药浓度。在中医外治处方中川芎常与乳香、没药配伍，广泛应用于心血管疾病、风湿痹痛、月经不调、跌扑肿痛等治疗中[6]。乳香、没药以挥发油类成分为主，因此研究乳香、没药挥发油对川芎的促透作用及其机制或可阐述其配伍意义。

本研究从经皮渗透的角度，研究川芎提取物阿魏酸的经皮渗透特性，比较川芎与乳香、没药配伍前后阿魏酸的透皮量变化，探索乳香、没药对川芎透皮吸收的影响，并从皮肤血流变化角度阐述其促透机制，为外用复方制剂配伍研究提供新思路。

1 材料

TT-6D 型药物透皮扩散试验仪（天津市正通科技有限公司，配套改良Franz扩散池）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Moor VMS型激光多普勒血流与温度检测仪（英国Moor Instruments 公司）；ESJ182-4型电子分析天平（1/10万沈阳龙腾电子有限公司）；XW-80A涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）；KQ3200E型超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）。

乳香饮片（批号150914，产地云南）、没药饮片（批号151227，产地云南）、川芎饮片（批号150805，产地四川），均购自江西樟树药材市场，经江西中医药大学中药鉴定教研室邓可众教授鉴定为正品；乳香、没药挥发油采用2010年版《中国药典》附录挥发油提取甲法提取，得淡黄油状溶液，无水硫酸钠脱水后密封避光保存。

阿魏酸（纯度>98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号151103）；1，2-丙二醇（西陇化工股份有限公司，批号151123）；冰醋酸（西陇科学股份有限公司，批号160517），甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

健康雄性KM小鼠，体重（20±2） g，健康雄性SD大鼠，体重（200±20） g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2013-0004。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 川芎溶液制备 取川芎药材适量，加8倍量80%乙醇，提取3次，每次2 h，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩，减压干燥；精密称取川芎提取物适量，加1，2-丙二醇-蒸馏水（80∶20）溶剂系统超声溶解完全，即得。

2.1.2 实验用药制备 分别取适量乳香挥发油、没药挥发油、乳没单提等体积混合挥发油、乳没等重混合提取挥发油、氮酮于10 mL量瓶中，加川芎溶液溶解定量至刻度线，超声并涡旋使挥发油充分分散，即得。

2.2 HPLC测定川芎阿魏酸含量

2.2.1 色谱条件 菲罗门C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-l%醋酸溶液（20∶80），流速1.0 mL·min-1，检测波长为321 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL，阿魏酸的相对保留时间约为12.00 min，理论塔板数阿魏酸峰计算不低于5 000。

2.2.2 方法学考察 配制阿魏酸对照品溶液、体外透皮试验空白接受液及川芎提取物体外透皮试验接受液，考察方法专属性、线性关系、精密度及加样回收率、稳定性。专属性见图1，接受液中其他成分对川芎阿魏酸的测定无干扰，阿魏酸在0.123～12.3 mg·L-1线性关系良好（Y=63.524X-2.062 6，r=0.999 9），低、中、高3個质量浓度（0.123，2.46，12.3 mg·L-1）的日内精密度分别为0.96%，0.18%，0.37%，日间精密度分别为2.3%，0.51%，1.9%，加样回收率分别为103.8%，99.35%，95.71%；川芎提取物体外透皮试验接受液的含量测定，2日内RSD为0.81%。

2.3 体外透皮研究

2.3.1 离体小鼠腹皮的制备 小鼠颈椎脱臼处死，剥离取下腹部去毛后皮肤，小心除去皮下脂肪及粘连物，生理盐水漂洗至无浑浊，滤纸吸干，置于锡箔纸上，-20 ℃保存，于实验前1 d取出，自然解冻。

2.3.2 川芎体外透皮研究 采用改良的 Franz扩散池，容积为5.0 mL，有效扩散面积为0.64 cm2，将处理好的皮肤置于扩散池上，真皮层面向接受池，表皮层面向供给池，夹紧，置于（37±0.5） ℃水浴中，加入转子（转速100 r·min-1）。准确移取2 mL供给液，注入供给池中，接受池中准确加入30%无水乙醇的生理盐水，在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h时取样1 mL，补加等体积新鲜接收液，所得样品以0.22 μm微孔滤膜过滤，测定阿魏酸含量。

2.4 皮肤血流量

2.4.1 动物分组与给药 将SD大鼠编号随机分为5组，分别为溶剂基质组、乳香组、没药组、乳没单提混合组、乳没混合提取组（每组为1，2-丙二醇-蒸馏水80∶20溶剂系统配制的3%乳香、没药挥发油样品处理）。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，电动剃毛器剔除耳局部毛发，并使大鼠适应恒温实验室内温度30 min，使体表温度与室温平衡。恒温实验室的温度控制在29～30 ℃，实验前后温度变化不超过1 ℃。实验时分别给各组大鼠耳内侧皮肤等面积均匀涂布等体积相应挥发油样品。

2.4.2 激光多普勒血流仪检测 实验开始，受试大鼠取俯卧位，平伸并固定四肢，从表面寻找大鼠耳局部血管，固定激光多普勒血流检测探头于大鼠耳外侧，给药前后仪器示数均稳定5 min后开始记录数据，给药前连续监测30 min基础血流值。给药后每10 min记录1次，取平均值，共监测观察至60 min处。保持给药前后检测位点不变。

2.5 數据处理与分析

2.5.1 体外透皮数据 根据如下公式计算各个时间点的阿魏酸累计透过量。

Qn=VCn+∑n-1i=1CiViA

式中A为有效经皮吸收面积，V为接受液体积，Vi为取样体积，Cn为第n个取样点测得的接受液中药物质量浓度，Ci为第i（i≤n-1）个取样点测得的接受液中药物质量浓度。以不同时间的Q对t作图，对作图后直线部分的Q对t进行线性回归，所得斜率即为药物的经皮吸收速率（Jss），直线部分反向延长线与X轴的交点即为滞后时间（Tlag）。为进一步比较促透剂的促渗效果，按下列公式计算其经皮促渗倍数： ER（enhancement ratio）= Jss（含促透剂）/ Jss（不含促透剂）。

2.5.2 皮肤血流量数据 采用MoorVMS数据分析软件，分析大鼠耳局部皮肤给药前，给药后10，20，30，40，50，60 min的血流平均值，最后结果以给药后各时间点的血流值与给药前基础血流值之比即皮肤血流变化值表示。SPSS 17.0软件统计处理，数据以±s表示，采用t检验分析和单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 透皮实验

乳香、没药挥发油对川芎中阿魏酸体外渗透动力学曲线及相关经皮渗透参数的影响，分别见表1，图2。

由结果可知，氮酮对川芎中阿魏酸经皮渗透的促进作用倍数为6.55，乳香、没药及其混合配伍挥发油对川芎经皮渗透的促进作用倍数分别为7.68，8.26，8.28，表明乳香、没药挥发油配伍前后对川芎指标成分阿魏酸均具有一定的促渗透作用，且配伍后促渗作用最强；而乳香、没药挥发油1∶1混合后促进作用倍数为7.26，表明两者挥发油简单混合应用会相互抑制对方的经皮促进作用，但仍大于氮酮。

因此，乳香、没药挥发油配伍前后对川芎均有一定的促透作用，且配伍后提取所得挥发油促透作用增强。

3.2 皮肤血流变化

基质对大鼠耳局部皮肤血流量的影响，乳香、没药挥发油单用及其配伍对大鼠耳局部皮肤血流的影响，各组大鼠耳局部皮肤血流改变的比较见表2，3。

由表2可知，在溶剂基质涂布于大鼠耳局部60 min内，大鼠耳局部皮肤血流无明显变化，说明本实验所用的的溶剂对大鼠耳局部皮肤血流量没有影响。

由表3可知，实验中各组大鼠耳局部皮肤血流量相比涂药前出现显著性差异的时间点略有差异，分别为乳香组10 min、没药组20 min、乳没单提混合组30 min及乳没混合提取组10 min。在前30 min各组对大鼠耳局部皮肤血流改变值无差异；在40 min时乳香挥发油对大鼠耳局部皮肤血流改变值最大，且优于没药挥发油；在50 min时乳香挥发油对大鼠耳局部皮肤血流改变值最大，其次是混合提取挥发油，没药挥发油效果最弱，且乳香挥发油效果优于没药挥发油、单提混合挥发油，混合提取挥发油效果优于没药挥发油。在50 min时乳香挥发油对大鼠耳局部皮肤血流改变中，乳香挥发油、混合提取挥发油效果优于没药挥发油、单提混合挥发油。因此，乳香、没药挥发油均具有一定的促血流作用，且乳香、没药单独及合提所得挥发油均具有起效快的特点，乳香挥发油促血流效果最优，没药挥发油可能会影响乳香挥发油的促血流效果，但是两者合提时该抑制效果减弱。

4 讨论

近年来，中药挥发油作为经皮给药促透剂的研究已成热点。研究发现中药挥发油大多具有良好的透皮吸收促进效果[7-8]，对其促透机制研究已为当下一大热点。扰乱高度有序排列的皮肤角质层结构[9]、拉动效应[10]、增强皮肤角质层的水合作用[4]，是目前普遍认为的中药挥发油促渗机制。

活血类中药药对乳香、没药，乳香味淡性温，气香而走窜，善理气活血；没药气薄味苦，重在化瘀理血，古今医家每每将此二者相须为用[11]。挥发油类成分是乳香、没药的主要有效成分，乳香、没药含有烯类、醛类、酸类等挥发油，其主要挥发油成分乙酸辛酯具有显著的促透作用[12-13]。从体外渗透动力学曲线及相关经皮渗透参数可发现，乳香、没药挥发油配伍前后对川芎指标成分阿魏酸均具有一定的促渗透作用，混合提取所得挥发油促渗作用最强；而单提混合所得挥发油促进作用倍数小于两者单用，表明两者挥发油简单混合应用会抑制经皮促进作用。有文献报道川芎挥发油也有促进药物经皮渗透的作用[14]，文章以川芎作为模型药，可能会干扰该文中乳香、没药挥发油促透作用的评价。但是，该文在设计体外透皮实验时就有考虑川芎挥发油的存在，采用平行对照，设置了川芎空白体外透皮组，可扣除川芎挥发油促透作用的干扰。因此，文章从体外透皮实验评价乳香、没药挥发油对川芎经皮渗透的促进作用是可行的。

近年研究表明，中药挥发油可通过促进皮肤血流以达到皮肤促透效果[4]。虽然表皮和真皮内的血液脉管系统并非是影响药物透皮的主要因素，但增加皮肤血流，可增加药物在皮肤中的消除速率，出现漏槽效应，从而实现药物促透[14]。透皮吸收促进剂在促进皮肤微循环血流过程中具有其固有的起效时间、维持时间及透皮作用强度。本实验中，乳香、没药、混合提取所得挥发油均具有起效快的特点，乳香、没药挥发油均具有一定的促血流作用，乳香挥发油促血流效果优于没药、乳没药对挥发油，没药挥发油可影响乳香挥发油的促血流效果，但是两者合提时该抑制效果减弱。

通过研究发现，乳香、没药挥发油配伍前后对川芎均有一定的促透作用，尚可通过增加皮肤血流，促进药物从皮肤表皮到真皮层毛细血管的消除，从而实现促透。然乳香、没药挥发油促川芎透过皮肤角质层的具体作用机制，乳香、没药混合提取所得挥发油与乳香、没药混合挥发油二者之间的作用差异机制，都尚不清楚，有待进一步研究。

[参考文献]

[1] 吕邵娃，潘世伟，付起凤，等.脐部给药剂型的发展概况与展[J].中医药学报，2015， 43（6）：109.

[2] Valgimigli L，Gabbanini S，Berlini E，et al.Lemon（Citrus limon Burm.f.）essential oil enhances the transepidermal release of lipid-（A，E） and water-（B6，C）soluble vitamins from topical emulsions in reconstructed human epidermis[J].Int J Cosmet Sci，2012，34（4）：347.

[3] Ahad A，Aqil M，Kohli K，et al.Interactions between novel terpenes and main components of rat and human skin：mechanistic view for transdermal delivery of propranolol hydrochloride[J].Curr Drug Deliv，2011，8（2）： 213.

[4] 王慧菁， 張立超， 张永佳， 等. 川芎挥发油增加皮肤血流皮肤促透机制[J]. 中国药学杂志， 2010， 45（24）： 1925.

[5] 刘珂伟，傅茂润. 阿魏酸的研究进展[J].江苏调味副食品，2016， 144（1）：7.

[6] 李伟霞，黄美艳，唐于平，等.基于代谢组学研究佛手散对血虚小鼠的养血补血作用机制[J]. 药学学报，2013， 48（8）：1301.

[7] 蒋秋冬，杨文国，蔡皓，等.透皮促渗中药挥发油的化学成分与中药药性关联性研究[J].中国中药杂志，2016，41（13）：2500.

[8] 罗红梅，马云淑，黄金娥，等. 丁香等3种挥发油对磷酸川芎嗪贴剂的促渗作用[J].中国医院药学杂志，2013，33（13）：1032.

[9] 张春凤， 战伟， 杨中林， 等. 双环单萜促透剂对川芎嗪透皮吸收的影响[J]. 药学学报， 2010， 45（11）： 1452.

[10] 李莉， 韩国柱. 中草药挥发油类透皮吸收促进作用研究进展[J]. 中国新药杂志， 2008， 17（11）： 914.

[11] 吴嘉瑞， 金燕萍， 张冰， 等.基于关联规则与熵聚类的化瘀类中成药组方规律研究[J]. 中国医药导报， 2015， 12（13）： 117.

[12] Rastogi S K， Singh J. Lipid extraction and iontophoretic transport of leuprolide acetate through porcine epidermis [J]. Int J Pharm，2001，215（12）： 241.

[13] 赵金凤. 乳香和没药挥发性成分的分析及其经皮吸收研究[D]. 济南： 山东中医药大学， 2011.

[14] 刘叶玲. 川芎挥发油促进丹皮酚的经皮渗透研究[J]. 中国药业， 2013， 22（5）： 6.

[15] Kim Y C， Song J M， Lipatov A S， et al. Increased immunogenicity of avian influenza DNA vaccine delivered to the skin using a microneedle patch[J].Eur J Pharm Biopharm，2012，81（2）：239.