产果胶酶疣孢青霉菌株TS63—9发酵条件优化及其在烟草中的应用

贺兆伟　奚家勤　李玉娥　金洪石　金江华　宋纪真

摘要：为考察碳源、培养时间、温度、起始pH等因素对产果胶酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9发酵产酶的影响，对该菌株发酵条件进行了优化，并考察了最优发酵条件下粗酶液在烟丝中的应用效果。结果表明，TS63-9液体发酵最佳碳源为烟梗粉末，添加量7.5 g/L；最适培养温度为28 ℃，最适起始pH为6.0；经优化后，在摇床转速200 r/min条件下培养72 h，粗酶液果胶酶活性达到832.49 U/mL。将此粗酶液添加应用于烟丝后，可显著降低烟丝果胶含量，感官质量得到一定程度改善；通过扫描电镜观察烟丝表面细胞排列特征，发现细胞间隙变大，细胞间隙比例提高。

关键词：疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）；果胶酶；发酵条件优化；烟丝；感官品质

中图分类号：TQ925+.3：TS41 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0686-05

果胶质是组成细胞壁结构的成分之一，是一种存在于相邻细胞壁间将细胞粘着在一起的亲水性胶体物质。果胶质对烟叶的吸湿性和弹性有一定的作用，但含量过高时会导致焦油生成量的增加[1]。另外，果胶是卷烟烟气中甲醛、乙醛等挥发性羰基化合物的一种重要前体物，而甲醛是一种I类致癌物，乙醛具有纤毛毒性，可减少肺巨噬细胞的数量[2-4]。Zhou等[5]通过模拟卷烟阴燃的条件对果胶的裂解行为进行了分析，检测出裂解气体产物主要包括CO2、H2O、CO、甲醇、甲烷以及挥发性羰基化合物。降低烟叶中的果胶质含量不仅可改善烟叶品质，而且可减少焦油生成量及烟气有害成分。采用商品化的果胶酶或者产果胶酶微生物及发酵液均可以降解烟草中的果胶。于建军等[6]将果胶酶的水溶液喷于烟丝上，有效地降低了烟丝中的果胶含量，并提高了中性香味物质的总量。邓国宾等[7]利用从优质烟叶中分离的产果胶酶黄曲霉（Aspergillus flavus Link）DPE-005菌株发酵产生的酶液来处理上部烤烟，结果改善了上部烟的吸味品质。另外，醇化片烟中的微生物在烟叶的醇化过程中起着重要的作用[8]。试验从醇化片烟中筛选出一株产果胶酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9[9]，对该菌株的发酵产酶条件进行了优化，并考察了发酵粗酶液在烟丝中的应用效果，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料 产果胶酶疣孢青霉菌株TS63-9[9]系本实验室从广西壮族自治区贺州市生产的B2F醇化片烟分离而得，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.6747。烟叶样品为云南省昌宁县2014年初烤烟叶，品种为红花大金元，等级为C3L，采用QS-5实验室烟叶切丝机制备烟丝样品。

1.1.2 试剂及仪器 试剂主要有果胶（美国Sigma-Aldrich公司）、D-半乳糖醛酸（纯度97%，美国Sigma-Aldrich公司）、DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸10 g，氢氧化钠10 g、酒石酸钾钠200 g，苯酚2 g、无水亚硫酸钠5 g，用去离子水定容至1 000 mL，棕色瓶贮存；苯酚重蒸，其余为化学分析纯）、果胶酶（Pectinase，活性≥50 000 U/g，BioDEE）。仪器主要有UV-2300紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）、生化培养箱、振荡培养箱、冷冻离心机（日本Hitachi公司）、AA3连续流动分析仪（德国布朗卢比公司）、TM3000台式扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）。

1.1.3 基础产酶培养基 成分为果胶5 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、（NH4）2SO4 1.4 g/L、尿素 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl2 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 56 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl2·6H2O 0.002 g/L，pH 6.0[10]。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备 疣孢青霉菌株TS63-9划线接种于PDA斜面培养基上，28 ℃培养48～72 h，加入无菌水振荡后得到孢子悬浮液（孢子浓度106个/mL），将孢子悬浮液以5%的接种量接入盛有30 mL产酶培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、200 r/min的条件下摇瓶发酵72 h；发酵产物在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 果胶酶活性测定 采用DNS显色法[11]测定果胶酶活性，在10 mL具塞刻度试管中加入1.0 mL 0.5%果胶溶液（pH 4.0柠檬酸缓冲液配制），加入0.5 mL粗酶液，55 ℃水浴反应40 min后，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，取出后用自来水迅速冷却至室温，定容至10 mL。以灭活酶液为对照，在540 nm处测定吸光度，根据半乳糖醛酸标准曲线计算还原糖含量。在上述反应条件下，以每小时水解果胶底物产生1 mg半乳糖醛酸的酶量为1个酶活性单位，用U/mL表示。

1.3 发酵条件优化

分别以碳源、培养时间、温度、起始pH为因素进行单因素试验，比较对疣孢青霉菌株TS63-9发酵产酶的影响。

1.3.1 碳源种类对菌株发酵产酶的影响 在产酶培养基中，分别用5 g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-半乳糖醛酸、玉米粉、麩皮、橘皮粉、烟梗粉末代替果胶作为碳源，接种疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min条件下培养72 h，测定不同碳源种类对果胶酶活性的影响，以确定最适合碳源。

1.3.2 碳源浓度对菌株发酵产酶的影响 将碳源浓度分别设为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L，接种疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min条件下培养72 h，测定不同碳源浓度对果胶酶活性的影响，以确定最佳碳源浓度。

1.3.3 培养时间 将疣孢青霉菌株TS63-9接种于最佳碳源的产酶培养基中，在28 ℃、200 r/min条件下进行液体发酵，每隔24 h测定一次果胶酶活性，比较培养时间对发酵产酶的影响。

1.3.4 温度 将疣孢青霉菌株TS63-9接种于最佳碳源的产酶培养基中，分别于20、24、28、32、36、40 ℃环境里、摇床转速200 r/min的条件下培养72 h，测定不同温度对果胶酶活性的影响。

1.3.5 起始pH 分别调节培养基起始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种疣孢青霉菌株TS63-9后，在28 ℃、200 r/min条件下培养72 h，测定不同起始pH对发酵产酶的影响。

1.4 粗酶液应用效果分析

1.4.1 粗酶液应用方式 烟丝于22 ℃、相对空气湿度60%条件下平衡48 h以上，按照表1的试验设计，用喉头喷雾器（接空压泵）将最优发酵条件下获取的粗酶液均匀喷于烟丝上，每个处理重复3次。喷后置于塑料袋内密封，放于烘箱中40 ℃条件下处理8 h，再80 ℃处理20 min，使酶失活。

1.4.2 测定项目及方法 取少量样品于40 ℃干燥12 h，磨碎过40目筛后测定果胶含量[12]，根据文献[13]测定烟末含水率。参照文献[14]要求，由郑州烟草研究院评吸专家委员会对样品进行感官质量评吸，并进行定性描述。利用TM3000扫描电镜观察烟丝表面细胞排列特征，用Photoshop CS5软件对所得电镜图片进行处理，计算细胞间隙的比例[15]。

1.5 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2007程序处理，并用其制表和绘图；运用SPSS 22统计软件进行Duncan′s 新复极差法多重比较。

2 结果与分析

2.1 疣孢青霉菌株TS63-9发酵条件的优化

2.1.1 碳源种类及浓度对菌株产酶能力的影响 不同碳源对疣孢青霉菌株TS63-9产酶能力的影响情况见表2。从表2可见，TS63-9在供试碳源中均能产生果胶酶，但不同碳源的果胶酶活性有很大差异。以葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖醛酸、可溶性淀粉作为惟一碳源时，发酵液的果胶酶活性均低于10 U/mL；以成分较复杂的玉米粉、麸皮作为惟一碳源时，酶活性有所提高；而以果胶、橘皮粉、烟梗粉末作为惟一碳源进行发酵后，酶活性大大提高，尤其以烟梗粉末作为碳源的产酶效果最好，果胶酶活性达到了814.32 U/mL，与其他碳源的差异均达到了极显著差异（P<0.01）。果胶酶是一种诱导酶，利用真菌进行液体发酵时，一定量的含果胶底物有利于产果胶酶。烟梗作为烟草工业的副产物，较易获得，且含有的成分和种类与烟叶基本一致，因此选用烟梗粉末作为果胶酶液体发酵底物是最佳的选择。

不同添加量的烟梗粉末对疣孢青霉菌株TS63-9产果胶酶能力的影响情况见图1。从图1可见，当烟梗粉末添加量为7.5 g/L时，果胶酶活性最大；而当添加量高于7.5 g/L时，果胶酶活性变化不大，且随着继续增加呈现出下降的变化趋势；说明烟梗粉末添加量在7.5 g/L时是最合适的。

2.1.2 培养时间对菌株产酶能力的影响 培养时间对疣孢青霉菌株TS63-9产酶能力的影響情况见图2。从图2可见，在摇瓶发酵前期，由于孢子数量相对较少，代谢活动较弱，酶活性非常低；随着培养时间延长，酶活性急剧升高，在72 h时达到最高值。随后随着营养物质的消耗以及菌株代谢活动的减弱，酶活性趋于稳定，整体上呈现出逐渐降低的变化趋势。

2.1.3 温度对菌株产酶能力的影响 培养温度对疣孢青霉菌株TS63-9产酶能力的影响情况见图3。从图3可见，疣孢青霉菌株TS63-9在不同的培养温度下产酶能力有较大的差异，果胶酶活性随着温度的升高而变化大，在28 ℃时达到最大值，此时TS63-9的产酶能力最强。但随着培养温度继续升高，酶活性显著降低，产酶能力减弱。

2.1.4 培养基起始pH对菌株产酶能力的影响 培养基起始pH对疣孢青霉菌株TS63-9产果胶酶的影响情况见图4。从图4可见，菌株在pH 5.0～7.0具有较强的产酶能力，以pH为6.0时果胶酶活性最高，而pH大于7.0或者小于5.0均不利于菌株产果胶酶。

2.1.5 优化的发酵条件测粗酶液果胶酶活性 将上述单因素试验得到的最佳条件（碳源为烟梗粉末7.5 g/L，最适培养温度为28 ℃，最适起始pH为6.0，在摇床转速200 r/min条件下培养72 h）组合在一起，测定疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液的酶活性，结果粗酶液的果胶酶活性达到832.49 U/mL，比果胶为底物的果胶酶活性227.56 U/mL提高了约2.66倍。

2.2 TS63-9果胶酶在烟丝中的应用效果

2.2.1 粗酶液对烟丝果胶含量的影响 疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液添加应用于烟丝后，对烟丝果胶含量的影响情况见图5。从图5可见，与空白对照相比，喷施TS63-9发酵粗酶液能不同程度地降低烟丝中的果胶含量。其中T2、T4、T6处理的果胶含量分别为7.99%、5.39%、4.96%，比对照的果胶含量9.03%分别减少了11.5%、40.3%、45.1%，随着酶液添加量的增多而减少，与对照差异极显著（P<0.01）；T1、T3、T5处理的烟丝果胶含量与对照相比几乎没有发生变化，差异不显著（P>0.05），说明高温使酶失活，失去了降解果胶的能力。另外，T4、T6处理与T2处理相比，果胶含量变化明显，差异极显著（P<0.01）；而T4与T6处理之间差异不显著（P>0.05），可见酶添加量达到一定的水平后，果胶含量减少的趋势在变缓。

2.2.3 粗酶液对烟丝感官评吸质量的影响 具有疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液正常酶活性的处理对烟丝感官质量的影响情况见表3。从表3可见，不同处理烟丝的感官质量整体差异不大，属于“中等”档次。其中，T2处理的烟丝与对照相比感官品质没有发生变化；T4处理与对照相比感官质量明显变好，表现为香气量有所增加，相对饱满，浓度增加，烟气浓郁；而T6处理与对照相比感官质量有所下降，主要表现为刺激性增大，可能是由于粗酶液添加量过多、导致烟叶化学成分变化较大、影响了内在成分的协调性所致。

2.2.4 烟丝表面细胞形态结构特征的扫描电镜观察 疣孢青霉菌株TS63-9发酵粗酶液应用于烟丝后，果胶含量明显降低，其表面细胞排列结构也发生了变化；不同处理烟丝表面扫描电镜图像情况见图6。从图6可以看出，对照以及T1、T3、T5处理的细胞排列紧密，T2、T4、T6处理的表面细胞排列疏松，细胞间出现间隙，且空隙的平均大小随粗酶液添加量的增多而变大。利用Photoshop CS5图像处理软件计算放大600倍的图像中细胞间隙比例，结果见图7、表4。由图7、表4可以看出，经粗酶液处理后，烟丝表面细胞的间隙比例明显变大，T2、T4、T6处理的细胞间隙比例分别比对照提高了53.30%、84.14%、112.94%。

3 小结与讨论

1）通过对产果胶酶疣孢青霉菌株TS63-9发酵条件优化试验，获得了其液体发酵优化条件为碳源烟梗粉末7.5 g/L、培养温度28 ℃、培养基起始pH 6.0、在摇床转速200 r/min条件下培养时间72 h，其余不变。在此条件下，TS63-9果胶酶活性为832.49 U/mL，比优化前提高了约2.66倍。说明烟梗粉末作为碳源对TS63-9产果胶酶有很大的影响，能够大大提高菌株的产酶能力。在微生物发酵产果胶酶时，以往多利用水果残渣如柠檬皮[16]、橘皮[17]，玉米浆[18]以及甜菜渣[19]等复合基质代替果胶作为碳源，而以烟草基质为底物进行发酵产果胶酶的相关研究未见报道。

2）在最优发酵条件下获得的疣孢青霉菌株TS63-9发酵粗酶液处理烟丝后，烟丝的果胶含量明显降低；感官品质在一定程度上得到改善，主要表现为香气量有所增加，烟气浓度增大，饱满浓郁；利用扫描电镜观察烟丝表面细胞排列特征，发现处理后烟丝细胞间隙变大，细胞排列更加疏松。

3）果胶作为一种大分子物质，与卷烟烟气中多种有害成分有关，关于疣孢青霉菌株TS63-9对卷烟烟气中相关有害成分含量的影响，有待下一步深入试验，并且TS63-9发酵粗酶液的安全性评价也需同步研究。

4）试验是在实验室条件下对微生物降解烟丝果胶含量进行了初步探索，作用条件及应用范围与实际生产还存在一定差异；下一步将模拟卷烟生产工艺，结合制丝工序，进一步探讨添加量、时间、温度等条件对疣孢青霉菌株TS63-9果胶酶降解烟草（烟叶、烟梗等）果胶含量的影响。

参考文献：

[1] 朱大恒，李彩霞.烟气有害成分与烟叶化学成分的关系[J].烟草科技，1999（4）：25-27.

[2] SEEMAN J I，DIXON M，HAUSSMANN H J. Acetaldehyde in mainstream tobacco smoke：Formation and occurrence in smoke and bioavailability in the smoker[J].Chemical Research in Toxicology，2002，15（11）：1331-1350.

[3] BAKER R R. The generation of formaldehyde in cigarettes—overview and recent experiments[J].Food and Chemical Toxicology，2006，44（11）：1799-1822.

[4] IRAC. Monographs on the evaluation of the carcinogenic risks to humans. Formaldehyde，2-Butoxyethanol and 1-tert -Butoxy-2-Propa-nol[R]. Lyon：France，International Agency for Research on Cancer，2004.

[5] ZHOU S，XU Y，WANG C，et al. Pyrolysis behavior of pectin under the conditions that simulate cigarette smoking[J].Journal of Analytical and Applied Pyrolysis，2011，91（1）：232-240.

[6] 于建軍，马海燕，杨寒文，等.利用果胶酶降解烟叶中果胶的研究[J].江西农业学报，2009，21（3）：136-138.

[7] 邓国宾，李雪梅，李成斌，等.降果胶菌改善烟叶品质研究[J].烟草科技，2003（11）：17-18.

[8] 杨金奎，段焰青，陈春梅，等.醇化烟叶表面可培养微生物的鉴定和系统发育分析[J].烟草科技，2008（11）：51-55.

[9] 贺兆伟，奚家勤，邓宾玲，等.烟叶中高产果胶酶菌株的筛选及酶学性质[J].烟草科技，2013（5）：72-76.

[10] MATHEW A，ELDO A N，MOLLY A. Optimization of culture conditions for the production of thermostable polygalacturonase by Penicillium SPC-F 20[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2008，35（9）：1001-1005.

[11] ZENI J，CENCE K，GRANDO C E，et al. Screening of pectinase-producing microorganisms with polygalacturonase activity[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，163（3）：383-392.

[12] 王 鵬，尚 军，戴迎雪，等.酶解-流动分析法测定烟草中果胶前处理方法的改进[J].烟草科技，2009（2）：50-52.

[13] YC/T 31-1996，烟草及烟草制品试样的制备和水分测定 烘箱法[S].

[14] YC/T138-1998，烟草及烟草制品感官评价方法[S].

[15] 过伟民，张艳玲，尹启生，等.一种利用Photoshop软件测定烤后烟叶表面细胞间隙的方法[P].中国专利：20121010145.5，2012-04-10.

[16] MART？魱NEZ-TRUJILLO A，ARREGU？魱N-RANGEL L，GARC？魱A-RIVERO M，et al. Use of fruit residues for pectinase production by Aspergillus flavipes FP-500 and Aspergillus terreus FP-370[J].Letters in Applied Microbiology，2011，53（2）：202-209.

[17] PEDROLLI D B，GOMES E，MONTI R， et al. Studies on productivity and characterization of polygalacturonase from Aspergillus giganteus submerged culture using citrus pectin and orange waste[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2008， 144（2）：191-200.

[18] TARI C，GOGUS N，TOKATLI F. Optimization of biomass， pellet size and polygalacturonase production by Aspergillus sojae ATCC 20235 using response surface methodology[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，40（5）：1108-1116.

[19] BAI Z，ZHANG H，QI H，et al. Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance[J].Bioresource Technology，2004，95（1）：49-52.