晚期非小细胞肺癌外周血EGFR基因检测与肿瘤抗原标志物的临床意义

沈立 沈红 杜兴冉 杜强 朱成华

晚期非小细胞肺癌外周血EGFR基因检测与肿瘤抗原标志物的临床意义

沈立1沈红1杜兴冉2杜强1朱成华1

目的 探讨原发性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血液肿瘤抗原标志物和外周血浆EGFR基因突变的关系，研究其对靶向治疗的价值。方法 选择NSCLC患者66例，无创检测外周血浆标本EGFR基因突变和血液肿瘤抗原标志物水平，评价两者的关系及临床意义。结果 本研究中NSCLC患者的EGFR基因突变率为43.94%。EGFR基因突变多发患者群为女性、非吸烟及肺腺癌(P<0.05),与年龄及肿瘤分期无显著相关性(P>0.05)。血浆EGFR基因突变阳性的患者血CEA水平比无EGFR基因突变的患者高，而SCCAg的水平比无EGFR基因突变的患者低，差异有统计学意义(P<0.05),其余指标NSE,Ca125,Cyfra21-1在EGFR基因突变型和野生型患者的比较中差异无统计学意义(P>0.05)。结论 对于血液中CEA升高和SCCAg降低的晚期NSCLC患者EGFR基因突变发生的可能性较大，选择这些患者行血浆EGFR基因检测无创安全且对靶向治疗有一定的指导意义。

非小细胞肺癌；血浆EGFR基因突变；肿瘤抗原标志物

肺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)治疗中起重要作用，EGFR突变是预测口服EGFR-TKI疗效的最有效因子，但临床组织标本获取存在不同程度的困难，有报道组织EGFR基因突变与CEA之间存在一定关联[1]，本文通过无创检测晚期NSCLC患者外周血浆EGFR基因突变情况，同时匹配血液肿瘤抗原标志物并观察两者相关性，从而为晚期NSCLC患者是否行EGFR基因检测及治疗提供相对精准的选择。

资料与方法

一、研究对象

连续收集2015年9月至2016年5月我院病理确诊为晚期NSCLC患者66例，男37例，女29例，年龄39-81岁，平均60.12岁。其中肺腺癌48例，非腺癌18例，包括磷癌17例，大细胞癌1例(见表1)。

二、 研究方法

1 标本采集：采集入组患者10mL全血置于EDTA管中，立即(或于4℃冰箱中2 h内)于1200 rpm离心20min，取上清6000 rpm再离心10min，然后分离血浆和血细胞并于-80℃保存直至提取。

2 DNA提取：血浆中循环肿瘤DNA的抽提采用上海允英公司的循环肿瘤DNA专用提取试剂盒 (Cat NO 23211)，所提产物需用Life Technology公司 Qubit测定浓度，浓度应不小于2ng/μL，根据测定浓度进行最终浓度调整至2-52ng/μL，高于这个浓度，应该用纯水进行稀释，低于这个浓度，应真空浓缩或者重新提取。合格标本应立即进行检测或-20℃保存。

表1 患者基本特征

3 EGFR基因突变检测: 采用竞争性阻遏PCR(Competitiv Blocker Q-PCR)技术检测EGFR基因突变，以肿瘤DNA(微量)作为模板，采用阻遏分子封闭EGFR野生型位点，使得PCR时突变特异引物只能以基因组为模板对突变靶序列进行高精度PCR扩增放大，利用Taqman-MGB荧光探针对扩增产物进行检测，并在实时PCR平台上对样本DNA中EGFR突变进行检测，每次PCR反应中，所有样品和阳性对照、无模板对照共同分析。检测步骤为：① 95℃ 10分钟， 1个循环；② 95 ℃ 10秒钟，60 ℃ 50秒钟，15个循环；③ 95℃10秒钟，60 ℃50秒钟，35个循环，于第三阶段60 ℃时收集FAM和HEX信号，执行实时PCR，保存文件。

突变结果判断：按检测说明书，EGFR检测每次试验均设定空白、野生型对照以及各突变的阴、阳性检测结果作为参照，首先确定样品各个反应管各自的突变Ct值，然后确定该样品的外控Ct值。ΔCt值=突变Ct值-外控Ct值。由于样品中突变百分比彼此不同，因而得出对应突变Ct值亦不等。根据不同的突变Ct值，把样品检测结果分为阴性、弱阳及强阳。Ct≥24为EGFR突变阴性，Ct<20 为EGFR突变阳性，20≤Ct<24为可疑阳性，需计算ΔCt值，当ΔCt<10，为突变阳性，反之则为阴性。

4 肿瘤抗原标志物的测定：抽取空腹肘静脉血3.0 mL，3500 r/min离心10 min取上清液，测定仪为罗氏2010全自动电化学发光免疫分析仪，使用配套试剂。采用电化学发光法测定癌胚抗原CEA(CEA)、血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖基抗原CAl25(CAl25)、非小细胞肺癌抗原(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCCAg)水平，

结 果

一、EGFR基因突变结果

共66例NSCLC患者行血浆EGFR基因检测，阴性37例，阳性29例,突变率为43.94%。(见表2)EGFR基因突变多发生于女性、非吸烟及肺腺癌患者(P<0.05)，与患者的年龄及肿瘤分期无明显相关性(P>0.05)。

二、血浆EGFR基因突变与血清肿瘤标志物的关系

表2 NSCLC患者EGFR基因突变与相关临床特征分析

血浆EGFR基因突变阳性患者其血清CEA值高于血浆EGFR基因野生型患者(P<0.05)，而血浆EGFR基因突变阳性患者血清SCCAg值低于EGFR野生型患者(P<0.05)。其余几项血清肿瘤标志物包括CYFRA21-1、NSE和CA125在EGFR基因突变型和野生型间差异无统计学意义，P>0.05。(见表3)。

表3 EGFR基因突变与血清肿瘤标志物的关系±s)

三、统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计，计数资料采用χ2检验， 两组间计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义

讨 论

已经证实EGFR-TKI在治疗EGFR敏感突变的NSCLC患者时其疗效明显优于传统化疗[2]。然而，组织活检样本具有局限性，如很多高龄患者诊断时已无法手术因而无标本可取，气管镜取材小，某些肿瘤解剖位置及肺部基础疾病不适和穿刺，穿刺本身诸多风险，反复取材患者接受程度低等[3]，IPASS研究中组织标本筛选成功率较低仅为36%[4],因此有必要选择更多的方法来预测EGFR-TKI的疗效。

“液体肿瘤学检测”因其操作可行性强、侵害性小、具有实时动态等特点正越来越受到临床关注。循环肿瘤DNA(ctDNA)是肿瘤细胞因凋亡和坏死而直接释放入外周血的DNA片段，携带有与肿瘤组织相关的信息[5-6]。王洁教授[7]报道230例NSCLC患者外周血EGFR突变与组织中EGFR突变的一致率为78%。最新研究认为甲醛溶液石蜡包埋技术对DNA的分子分析也会产生影响,每个样本中肿瘤细胞的数量与形态和取样的位置及大小有很大关系[8]，因此肿瘤病理组织活检可能不能反映整个病灶的完整信息。ctDNA来源于肿瘤原发灶和转移灶坏死凋亡的肿瘤细胞碎片，可能可以避免肿瘤组织的遗传异质性而体现整个肿瘤的遗传学特征[9-10]。本研究检测66例NSCLC患者血浆EGFR基因，结果发现EGFR基因突变阳性29例，突变率43.94%；同文献[11]报道相符,分层分析显示EGFR基因突变阳性率女性为62.07%,非吸烟患者为62.5%，肺腺癌患者为54.17%，据此可知EGFR基因突变多见于女性、非吸烟和肺腺癌患者(P<0.05)，而与年龄和肿瘤分期无关(P>0.05)。

肿瘤抗原标志物是由肿瘤细胞生物合成释放的一类物质，其中癌胚抗原(CEA)是肺癌患者的独立预后因素，血清CEA表达水平与NSCLC疗效及肿瘤的侵袭转移相关。Shoji等[12]将CEA浓度划分为3组，CEA≥20μg/L，5-19μg/L和<5μg/L,研究结果显示血清CEA浓度和EGFR突变检测阳性基本呈线性关系，推测CEA的变化可以预测EGFR-TKI的疗效。Jung等[13]提出假设：EGRF突变可激活下游信号通路，加速癌细胞分化致CEA蛋白表达升高。本文发现携带EGFR突变的患者其血清CEA水平较EGFR野生型患者明显升高(P<0.05)。我们推测，因CEA是细胞表面的糖蛋白，其本质是腺癌标志物，高CEA值预示肿瘤负荷大或肿瘤进展，因此CEA值升高可能与高EGFR突变率或EGFR突变的丰度升高有关。本文还发现EGFR突变患者中血清鳞状细胞癌抗原SCCAg水平明显低于EGFR野生型(P<0.05)。我们分析SCCAg为鳞癌特异性标记物，腺癌中表达极低，目前鳞癌的发病率较腺癌略低，而EGFR突变多见于腺癌，因此EGFR突变患者中血清SCCAg水平降低。

综上所述，血清CEA浓度升高与血浆EGFR基因突变相关，联合检测血清CEA及SCCAg对预测EGFR基因突变具有重要意义,有助于结合临床优势人群，经验性使用EGFR-TKIs治疗，并可以避免盲目选择昂贵的EGFR基因检测，减轻患者医疗费用。晚期NSCLC患者多采用局部取材，难以获取足量肿瘤组织进行EGFR基因检测，血浆EGFR检测无创安全，可重复性好有望弥补这一不足。然而，本研究由于样本量较少存在一定的限制，血浆EGFR基因突变检测尚处于起步阶段, 主要用于检测晚期肺癌患者，对于早期肺癌病变，该方法还不适合。需要进一步的大样本研究阐明存在于该现象背后的可能分子机制。

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Relationship between serum tumor markers and EGFR gene mutation in plasma circulating DNA from NSCLC patients

SHENLi,SHENHong,DUXing-ran,DUQiang,ZHUCheng-hua.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210011,China

Objective To investigate the relationship between serum tumor markers and plasma epidermal growth factor (EGFR) gene mutation in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and to explore its prognostic value. Methods The serum EGFR gene mutation and serum tumor markers of 66 NSCLC patients were detected, and the relationship between EGFR gene mutation and serum tumor markers was analyzed. Results 66 NSCLC patients were enrolled, and the mutation rate was 43.94%. EGFR gene mutation was mainly occurred in women, non-smoking and adenocarcinoma patients (P<0.05). When the serum CEA was elevated or the serum SCCAg decreased, EGFR mutation rate increased significantly (P<0.05). While there was no correlation between NSE, CA125, CYFRA21-1 and EGFR gene mutation (P>0.05). Conclusion For the patients whose EGFR gene mutation can not be tested, we can chose those with low serum SCCAg and high CEA, and according to their clinical characteristics, they will be given EGFR-TKIs treatment and EGFR gene mutation detection.

non-small-cell lung cancer; epidermal growth factor gene mutation; tumor markers

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.010

210011 江苏 南京，南京医科大学第二附属医院1.呼吸科、2.感染科

2016-06-28]