水体中叶绿素α测定方法的探究

李会玲，赵锋，豆艳霞

分析测试

水体中叶绿素α测定方法的探究

李会玲，赵锋，豆艳霞

（安康市环境保护监测站，陕西安康725000）

在环境监测中，叶绿素α的测定方法主要参照《水和废水监测分析方法》（第四版）中的分光光度法，该方法存在测定结果误差大的问题，同时暴露在高浓度丙酮环境中，对分析者的健康有损害影响。在原始方法的基础上进行了免研磨法提取叶绿素α，实验结果表明：该方法对叶绿素α提取率的提高率可达53.4%～62.8%，有效避免了研磨过程造成的叶绿素α损失，同时发现随着提取时间的增加，叶绿素α的测定值增加，且提取8 h后增长的趋势开始趋于稳定。

叶绿素α；免研磨法提取；提取率

叶绿素α是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素α，可掌握水体的初级生产力情况[1]。在环境监测中，可将叶绿素含量作为湖泊富营养化的重要指标之一[2-3]。美、日等发达国家对叶绿素α的测定已列入了标准分析方法，其中的测定方法包含了分光光度法，荧光法和高效液相色谱法[4]。目前，我国对叶绿素α的测定尚无国家标准，分析方法主要参考《环境监测技术规范》、《湖泊富营养化调查规范》和《水和废水监测分析方法》中的分光光度法[5]。

目前，水质监测工作中常用的方法是参照《水和废水监测分析方法》（第四版），但我们在实验过程中发现，研磨等多次转移操作会大大降低叶绿素α的提取率，导致测定结果误差，同时丙酮是一种极易挥发的有毒的有机溶剂，研磨过程中接触90%的高浓度丙酮，对人体健康造成很大的损害。鉴于以上问题，本文对第四版书中叶绿素α测定方法进行了简化改进，以期提高叶绿素α的提取率和稳定性，确保实验结果的准确度。

1 材料与方法

1.1 水样的采集

在发生富营养化的某库区（1#），库区上游未受污染段（2#），库区下游段（3#）3个采样点分别采集水样500 mL，低温（0℃～4℃）避光保存，次日测定。

1.2 水样的处理

水样的浓缩：装好抽滤装置，在抽滤器上装好醋酸纤维滤膜，过滤前在滤膜上加入少量的碳酸镁悬浮液（碳酸镁悬浮液成弱碱性，可以保护叶绿素防止酸化引起色素溶解），水样抽完后，继续抽1～2 min；提取：抽滤完成后，将带有样品的滤膜迅速对折成条状放入10 mL的玻璃比色管中，加入10 mL的90%丙酮后立即盖好盖子，用力上下振荡1 min，然后在黑暗中静置，提取时间分别设定为0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h（期间0．5 h震荡一次，以保证提取完全）；离心：静置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后将试样倒入10 mL的离心管中，用离心机（3000～4000 r/min）离心10 min。将上清液倒入10 mL容量瓶中，用丙酮定容，摇匀。

1.3 测定

将上清液倒入1 cm光程的比色皿中，放入紫外分光光度计中比色，在分别放置0 min、5 min、10 min、20 min、30 min后，读取750 nm663 nm645 nm630 nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

1.4 对照试验

在进行上述改进操作的同时，按照原始研磨测定方法（按《水和废水监测分析方法》中的操作），设置了对照实验。

2 结果与讨论

2.1 提取时间对实验结果的影响

从三个点位（1#富营养化某库区，2#未受污染的上游段，3#污染的下游段）采集的水样，按照上述材料与方法部分的操作，在提取步骤，静置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后分别取定容后的上清液测定吸光度，得到的提取时间对测定结果的影响见图1。由图1可知，同一提取时间条件下，富营养化库区中叶绿素α值最高，达2.7～12.9 mg/L，高于上游未受污染段水体的1.85～2.00倍，污染区的下游段叶绿素α为1.53～7.23 mg/L。从图1还可以看出：随着静置提取时间的增大，叶绿素α的测定值增加，表明叶绿素α的提取率增加，在静置提取约8 h后增长的趋势开始趋于稳定。因此，为了保证测定结果的准确，要控制好提取静置时间，以充分提取出水体中的叶绿素α。 2.2本实验方法与原始方法测定值的对比

图2为本实验中的改进方法中静置提取8 h后的测定值，与原始的操作方法（低温干燥8 h后再研磨提取）的测定值的比较。由图2可知，在该方法的操作条件下，同一水样叶绿素α的测定值增加了53.4%～62.8%，可见，该方法大大提高了叶绿素α的提取率，避免了研磨过程造成的损失。

图1 提取时间对测定值的影响

图2 两种测定方法的比较

2.3 测定时间对测定值的影响

按照材料与方法中的操作方法，样品离心提取后，分别在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min时测定其吸光度，测定值如图3所示。由图3可知，离心后的提取液放置的时间会对测定值造成影响：5 min以内影响不会太大；15 min以内有一定的影响；25 min以后影响比较大。可能是放置时间过长，引起色素分解造成的。因此，在测定离心提取液时要及时，防止因放置时间过长造成测量值偏低。

图3 测定时间对测定结果的影响

3 结论

（1）如果不是马上测量，水样需进行预处理，采集的水样加入碳酸镁悬浊液，（每升水样加1%碳酸镁悬浊液1 mL），以防止酸化引起色素溶解。

（2）为了使色素得到充分的提取，要对提取液进行充分多次振荡，要把提取时间控制在8～10 h之内，这样才能保证较高的提取效率，但不能无限制地延长提取时间，以防止色素分解。

（3）本实验的方法对叶绿素α的测定值提高了53.4%～62.8%，有效避免了研磨过程造成的叶绿素α损失。

（4）在测量吸光度时，应在5 min内迅速测量完毕，以防止色素分解，引起结果偏低。

[1]吴姝英.叶绿素α测定方法之比较[J].福建水产，2011，33（4）:61-63.

[2]国家环保局.水生生物监测手册[M].南京：东南大学出版社，1993:177-178.

[3]李胜生，董元华，刘云，等.微囊藻中提取方法的优化[J].环境监测管理与技术，2008，20（4）:43-45.

[4]刘枢.水体中叶绿素a测定方法探讨[J].农业与技术，2012，32（10）:9，36.

[5]金相灿，屠清瑛.湖泊富营养化调查规范[M].北京：中国环境科学出版社，1990:286-302.

[6]国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].第4版.北京:中国环境科学出版社，2002:670-672.

An Exploration for the Determination of Chlorophyll α in Water

LI Hui-ling，ZHAO Feng，DOU Yan-xia
（Environmental Monitoring Station of Ankang，Ankang，Shaanxi 725000，China）

The determination of chlorophyll α according to The Water and Wastewater Monitoring Analysis Method（the fourth edition）was used widely in environmental monitoring，there existed a biggest disadvantage of determinate error，another disadvantage is that it’s harmful to analysts who exposed to an analysis environment with high concentration of acetone.The method used in this paper was preferable due to avoiding grinding where a greater loss come about.The results showed that compared with the extraction efficiency under traditional method above，the extraction efficiency under this method increased by 53.4%～62.8%.The results also revealed that measured value increased with the growth of extraction time，and was tending towards stability after 8 hours.

chlorophyll α；extraction avoided grinding；extraction efficiency

1006-4184（2017）3-00052-03

2016-05-25

李会玲（1973-），女，陕西安康人，本科，工程师，研究方向：环境监测与分析。E-mail:846888501@qq.com。