HPV-16 URR突变对病毒早期启动子活性影响的研究

宋 丹，史 茜，侯向前，玛依努尔·尼亚孜，马正海

HPV-16 URR突变对病毒早期启动子活性影响的研究

宋 丹1，史 茜1，侯向前1，玛依努尔·尼亚孜2，马正海1

1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区人民医院妇产科，新疆 乌鲁木齐 830001

背景与目的：新疆是宫颈癌高发区，该地区宫颈癌高发与人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)感染密切相关。该研究旨在分析新疆地区妇女宫颈病样组织中HPV-16上游调控区(upstream regulatory region，URR)的突变及其功能。方法：以新疆妇女子宫颈上皮非典型增生(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌病样组织标本DNA为模板，PCR扩增HPV-16 URR片段，PCR产物经测序比对，筛选代表性的URR突变体构建至pGL3-Basic载体，将其转染Vero细胞，48 h后检测荧光素酶活性，分析URR突变体启动子活性。结果：采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)获得了55个HPV-16 URR DNA片段，测序及序列分析发现44个突变位点，其中nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4个位点的突变为所有序列共有，nt7520(G→A)位点的突变存在于54个样品中，剩余39个位点的突变存在于不同样品中。根据突变的位置、频率和程度，筛选出9个URR突变体分别克隆至pGL3-Basic中荧光素酶基因前并转染Vero细胞。荧光素酶活性分析表明，不同URR突变体的启动子活性差异较大，来源于宫颈癌的URR突变体启动子活性显著高于来源于CIN的URR突变体(P＜0.01)，部分宫颈癌URR突变体的启动子活性显著高于SiHa和Caski细胞来源的URR参照序列的启动子活性。结论：新疆地区分离的HPV-16 URR发生多位点突变，其中部分突变增强了URR内部启动子的活性，导致HPV-16致癌活性增强。

人乳头瘤病毒16型；上游调控区；突变；启动子

人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)为无囊膜的小型双链环状DNA病毒，可引起皮肤和黏膜的良性或恶性肿瘤。HPV的基因组全长约7 900 bp，分为早期区(E区)、晚期区(L区)和上游调控区(upstream regulatory region，URR)，E区编码具有转化活性的E6、E7蛋白以及调控病毒复制和基因表达的E1和E2蛋白，L区编码病毒衣壳蛋白，URR区包含病毒DNA复制起点(origin of replication，Ori)、E区启动子P97和调控病毒基因转录的多个顺式作用元件。

新疆南部维吾尔族聚居区是宫颈癌高发区，在前期研究中发现新疆妇女宫颈癌活检组织标本中分离的HPV-16 E6［1］、L1［2］、L2［3］基因以及URR［4］均发生突变，其中URR的突变最为频繁。本研究扩大宫颈癌病样数进一步分析新疆地区HPV-16 URR突变，并分析URR突变体内的启动子活性，以探讨新疆地区HPV-16 URR突变与宫颈癌高发间的内在联系。

1 材料和方法

1.1 宫颈病变组织

收集宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasiaⅠ，CINⅠ)10例、宫颈上皮内瘤样病变Ⅱ(cervical intraepithelial neoplasiaⅡ，CINⅡ)10例、宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ，CIN Ⅲ)27例和宫颈癌(cervical cancer，CC)组织标本51例。组织样本都来自新疆维吾尔自治区人民医院妇产科，均经病理学诊断。

1.2 质粒及细胞

非洲绿猴肾细胞Vero为永生化细胞，大肠杆菌DH5α和载体pGL3-Basic均为本实验室保存；SiHa和Caski均为整合了HPV-16基因组的宫颈癌细胞系，其URR作为阳性对照。

1.3 主要试剂

Ex Taq DNA聚合酶、DNA marker、T4DNA连接酶和限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA切胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；细胞转染试剂盒LipofectamineTM2000 Reagent购自美国 Invitrogen公司；引物合成与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 HPV-16 URR基因扩增

分别以新疆妇女宫颈病样组织基因组以及SiHa和Caski细胞基因组为模板，用HPV-16 URR特异性引物扩增URR片段，上游引物序列为：5’-GCTTGTGTAACTATTG TGTCA-3’，下游引物序列为：5’-GTCCTGA AACATTGCAGTTCTCT-3’，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增参数为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃终止。PCR产物回收后测序。

1.5 递归式PCR扩增W12 URR基因

永生化上皮细胞W12源自人类宫颈CINⅠ病变组织，W12 URR序列P97启动子活性较弱［5］，因此作为阴性对照组。根据GenBank报道的W12序列(GenBank accession no.AF125673)设计引物，递归式PCR扩增得到W12 URR片段。

1.6 HPV-16 URR基因筛选及构建重组质粒

测序后对HPV-16 URR序列进行分析，根据突变位点及频率筛选出具有代表性的突变株，将其构建至pMD18-T，同时将W12 URR片段构建至pMD18-T，重组质粒经Hind Ⅲ与KpnⅠ双酶切获得URR片段和W12 URR片段，与同样酶切的pGL3-basic载体在T4连接酶作用下于16 ℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株中，在含Amp+琼脂平板上挑选单菌落，增菌培养后以碱裂解法小量提取重组质粒，经Hind Ⅲ与KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒，并对酶切鉴定正确的质粒进行DNA测序鉴定。

1.7 荧光素酶检测分析

Vero细胞铺入12孔板，细胞长至约80%时，pGL3-URR转染Vero细胞，pGL3-basic空载体作为空白对照，SiHa和Caski URR重组质粒为阳性对照，W12 URR重组质粒为阴性对照，每组6个复孔，转染48 h后收集细胞，检测荧光素酶的活性。

1.8 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行处理。求每组平均值和方差，对实验组与对照组进行两组数据的成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈病样URR突变基因分析

以宫颈病样DNA为模板进行PCR扩增，共得到55个大小约为750 bp的URR片段，其中CIN来源的URR片段13个，宫颈癌来源的URR片段42个，测序后与公布的德国标准株URR序列(GI：333031)进行比对，发现44个位点发生突变，其中nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4个位点的突变为所有序列共有，nt7520(G→A)位点的突变存在于54份样品中，这5个位点的突变在新疆地区趋于恒定；其余39个位点的突变在部分样品中存在，分析结果见表1。

2.2 筛选URR突变体并构建pGL3-URR重组质粒

根据上述URR序列突变的位置、频率和程度，筛选出9个URR突变体并克隆入pGL3-Basic载体，获得重组质粒pGL3-URR-CINⅠ、pGL3-URR-CINⅡ、pGL3-URR-CINⅢ、pGL3-URRCC1、pGL3-URR-CC2、pGL3-URR-CC3、pGL3-URR-CC4、pGL3-URR-CC5和pGL3-URR-CC6，筛选的9个URR片段突变情况见表2。上述重组质粒经KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切产生约5 400 bp的质粒片段和约750 bp的URR片段，与预期结果相符，说明重组质粒pGL3-URR构建正确(图1)。

表1 宫颈癌和子宫上皮非典型增生组织中HPV-16 URR基因序列的变异Tab. 1 Variation of HPV-16 URR from cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia

表2 代表性URR突变体的变异Tab. 2 The variation of the typical URR mutants

图1 重组质粒pGL3-URR的酶切分析Fig. 1 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid pGL3-URR

2.3 荧光素酶活性分析

将不同URR突变体的pGL3-basic/URR重组质粒转染到Vero细胞，荧光素酶检测结果表明，不同URR突变体启动子活性存在较大差异，来源于宫颈癌的URR突变体启动子活性显著高于来源于CIN的URR突变体(P＜0.01)。CIN(CINⅠ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ)URR序列平均启动子活性是W12 URR启动子活性2.75倍，宫颈癌(CC1、CC2、CC3、CC4、CC5和CC6)URR序列平均启动子活性是W12 URR启动子活性12.62倍，其中CC2 URR启动子活性是W12 URR启动子活性的26倍，差异有统计学意义(P＜0.01)，是对照细胞SiHa和Caski URR启动子活性的1.26和 1.9倍，差异有统计学意义(P＜0.01，图2)。

图2 CIN和CC中HPV-16 URR片段启动子活性Fig. 2 The promoters activity of HPV-16 URR fragments from CIN and CC

3 讨 论

HPV-16早期基因的表达由URR上的P97早期启动子启动，启动子的活性受病毒早期蛋白和转录因子等调控，URR的突变可增强或减弱URR内部启动子的活性。HPV-16 URR以两个E2蛋白结合位点为界分成3个区域：5’区、3’区和中央区。5’区包含晚期转录产物的转录终止位点、多聚腺苷酸化位点［6］和转录调控蛋白E2结合位点［7］。3’区包含病毒的Ori，该元件在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用，Ori长度约100 bp，是一个相对保守的区域，含E1和E2蛋白结合位点，以及其他复制必需元件。E1蛋白和E2蛋白与Ori结合形成前起始复合物并起始病毒DNA的复制［8-9］。中央区为增强子区域，全长约400 bp，两端分别是E2蛋白的结合位点，包含了多种转录因子结合位点，如特异蛋白1(specificity protein 1，SP1)［10］、细胞核因子1(nuclaer factor-1，NF-1)［11］及阴阳因子1(yin-yang factor 1，YY1)等［12］，这些转录因子通过与URR结合调节P97启动子的活性，从而影响致癌基因E6、E7的表达。

核酸杂交和HPV-16核苷酸序列分析表明，不同地区、不同种族及不同人群HPV-16阳性标本中的HPV-16核苷酸序列存在大量变异，且变异谱系分布有着明显的地域性［13-16］。前期研究表明新疆地区HPV-16的各基因均有突变，其中URR也发生多位点的突变，本研究扩大样本后对HPV-16 URR突变进行分析，结果表明，nt7192(G→T)、nt7433(-→T)、nt7435(C→G)和nt7863(A→-)4个位点的突变为所有URR序列共有，除了CIN Ⅲ样品外，nt7520(G→A)位点的突变存在于其他54份样品中。本研究发现的一些突变现已报道，7192位(C→T)和7729(A→C)在亚裔美洲型(AA)中普遍存在［4,17］，nt7449(T→C)［4］、nt7843(A→G)［17］及nt7792(A→G)［18］的突变可显著提高URR启动子活性，其余的突变位点尚未见报道。

W12为来自人类宫颈CIN Ⅰ病变组织的永生化上皮细胞，W12 URR序列P97启动子活性较弱［10］，SiHa和Caski均为整合了HPV-16基因组的宫颈癌细胞系，其URR启动子活性较高，可作为URR启动子活性研究的阳性对照［19］。有研究发现，来源于宫颈癌的URR突变体启动子活性显著高于来源于CIN的URR突变体，其中CC2的URR启动子活性明显高于SiHa、Caski和其他病样的URR启动子活性，该URR突变体除普遍存在的5个位点的突变外，还存在nt7820-7868间的48个碱基缺失，且缺失片段中包括E2蛋白结合位点E2BS2， nt7820-7868间一些碱基的突变能增强URR启动子活性［18-21］。本研究中CC2的URR启动子活性是W12 URR启动子活性的26倍，推测nt7820-7868间的48个碱基的缺失也会增强URR启动子活性。

CC1、CC3和CC5样品除普遍存在的5个位点的突变外，还存在nt7841(G→A)位点的突变，Dong等［21-22］报道，HPV-16 URR序列中YY1蛋白结合位点(nt7840-nt7848)和SP1结合位点(nt7842-nt7847)重叠，SP1与YY1竞争性结合该位点，本研究中CC1、CC3和CC5样品URR启动子活性较W12 URR启动子活性提高了7、12和8倍，推测与nt7841(G→A)突变有关，该位点的突变可能改变了YY1、SP1转录因子的结合位点，从而使得URR启动子活性提高。有研究报道，位于3’-URR末端的nt7660-nt7890片段的突变是使亚裔美洲型(AA)URR序列启动子活性增强的主要原因［21］。本研究发现，所有URR序列在nt7660-nt7890位点都存在突变，如nt7729(A→C)、nt7841(G→A)和nt7863(A→-)等，且宫颈癌URR序列的突变位点多于CIN URR序列。

本研究中除了CINⅢ样品外，nt7520(G→A)位点的突变存在于其他54份样品中，该位点的突变在亚裔美洲型(AA)中普遍存在，其启动子活性较W12 URR启动子活性提高了3.3倍［23-24］，Schmidt等［25］也发现，该位点的突变改变了YY1、SP1和AP-1等转录因子的结合位点，从而增强了HPV-16的致癌活性。另有一些突变位点已被证实可增强URR启动子活性，如nt7792(C→T)位的YY1结合位点突变可显著提高启动子的转录活性［18］。此外，还有一些转录因子结合位点的突变尚未见报道，如nt7729(A→C)和nt7826(T→C)，据文献报道，这两个位点分别位于NF-1和1-Oct结合位点［19］，其突变也可能影响URR启动子活性。

上述结果表明，新疆妇女宫颈病变组织中分离的URR存在多个位点突变，其中一些突变增强了URR内部启动子活性，从而可能促进病毒致癌基因的复制，并最终促进其致癌活性。

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The ef f ect of mutations in the upstream regulatory region of HPV-16 on the activity of virus early promoter

SONG Dan1, SHI Qian1, HOU Xiangqian1, MAYINEUR·Niyazi2, MA Zhenghai1(1. College of

Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China; 2. Gynecology and obstetrics Xinjiang Uyghur Autonomous Region People’s Hospital, Urumqi 830001, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)

Background and purpose: The incidence of cervical cancer is rather high in Xinjiang, which is closely associated with the infection of human papilloma virus type 16 (HPV-16). The purpose of this study was to analyze the variants and function of HPV-16 upstream regulatory region (URR) in the tissues of cervical cancer biopsies from Xinjiang. Methods: The DNAs were extracted from the tissues of cervical epithelial atypical hyperplasia (CIN) and cervical cancer biopsies. HPV-16 URR segments were amplif i ed by PCR. Based on the sequence analysis of the URR, the representative URR variants were selected and cloned into pGL3-Basic. The recombinant plasmids were transfected into Vero cell lines respetively. Luciferase activity of transfected cells was detected 48 h after transfection. Results: Fifty-f i ve HPV-16 URR DNA fragments were obtained through PCR, and 44 mutations were found from the URR fragments. 4 of these mutations, including nt7192(G→T) , nt7433(- →T), nt7435 (C→G) and nt7863 (A→-) occurred in all sequences. The mutation at nt7520 (G→A) occurred in 54 URR sequences, and the 39 other mutations were present in dif f erent samples. Based on the location and frequency of the mutations in the URR fragments, 9 URRvariants were selected and cloned into pGL3-Basic. Then the luciferase activity of the cells transfected with pGL3-URR plasmids was detected respectively. Promoter activity of URR mutants from cervical cancer are significantly higher than that of URR mutants from CIN (P＜0.01). Promoter activity of URR fragments from some cervical cancer was signif i cantly higher than that of the URR fragments from SiHa and Caski cells. Conclusion: Multiple mutations occurred in HPV-16 URR of cervical cancer patients from Xinjiang. The promoter activity and carcinogenicity of some URR mutants have been enhanced.

Human papillomavirus type 16; Upstream regulatory region; Mutation; Promoter

MA Zhenghai E-mail: mzhxju@126.com

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.02.005

R737.33

A

1007-3639(2017)02-0109-06

2016-03-15

2016-09-10）

国家自然科学基金项目(31060025)。

马正海 E-mail：mzhxju@126.com