姜黄素调控食管癌Eca-109细胞分化、增殖、凋亡的机制

2017-03-24金宇斌李立德苗春兴李胜龙

中国老年学杂志 2017年4期

关键词：姜黄食管癌通路

金宇斌李立德韩莹苗春兴张霞李胜龙

(牡丹江医学院第二附属医院胸外科，黑龙江牡丹江 157009)

姜黄素调控食管癌Eca-109细胞分化、增殖、凋亡的机制

金宇斌李立德1韩莹苗春兴张霞李胜龙

(牡丹江医学院第二附属医院胸外科，黑龙江牡丹江 157009)

目的探讨姜黄素对食管癌Eca-109细胞的分化、增殖、凋亡及分泌信号蛋白(Wnt)信号通路的影响及机制。方法 MTT法检测8、16、32、64 μmol/L的姜黄素作用于食管癌Eca-109细胞24、48、72 h后细胞存活情况，计算细胞凋亡率，原位末端标记法(TUNEL)检测48 h后细胞凋亡情况，RT-PCR检测48 h后细胞中β连环蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc的mRNA的表达情况，Western印迹检测48 h后细胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc蛋白的表达情况。结果姜黄素对食管癌Eca-109细胞的抑制作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加，姜黄素作用24 h IC50为28.1 μmol/L，48 h为23.2 μmol/L，72 h为15.6 μmol/L。TUNEL检测细胞凋亡率随着药物作用浓度的增加而增加。β-catenin、c-myc的转录水平随着药物浓度的增加而减弱。GSK-3β的转录水平随着药物浓度的增加而加强。β-catenin、c-myc蛋白表达量随着药物浓度的增加而减弱。GSK-3β蛋白表达水平随着药物浓度的增加而加强。结论姜黄素可以抑制食管癌Eca-109细胞增殖，促进细胞凋亡。姜黄素可以上调Wnt信号通路中GSK-3β酶的表达、促进β-catenin蛋白降解，从而抑制c-myc基因的转录，抑制癌细胞生长增殖。

食管癌；增殖；凋亡；信号通路

食管癌早期发病症状不明显，确诊后一般已经发展到食管癌晚期〔1〕。常见的治疗方法有手术治疗、化疗和放射治疗。但手术治疗方法有限，化疗效果显著但副作用大，长期化疗会引起一系列的继发感染，损害人体其他正常细胞的正常功能。姜黄素是从姜科植物郁金块根、姜黄根茎等提取的一种植物多酚，具有利胆、抗金黄色葡萄球菌等药理作用〔2〕。对癌症、老年痴呆等具有治疗作用。姜黄素对胃癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌等具有很好的抑制作用〔3〕，目前姜黄素对食管癌的作用机制尚不清楚。分泌信号蛋白(Wnt)信号通路在细胞的生长增殖过程中起决定性作用，其中β连环蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc是该信号通路中关键因子〔4〕。本研究拟探讨姜黄素对食管癌细胞增殖凋亡的影响及与Wnt信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料细胞：食管癌细胞Eca-109购自中科院上海细胞所。主要仪器和设备：酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，紫外分光光度计(美国Thermo)，CO2培养箱(日本SANYO)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本尼康)，PCR仪(美国Beckman Coulter)，离心机(湖南恒诺医用设备有限公司)，反转录试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，RPMI-1640培养基(美国Sigma)，PCR扩增试剂盒(美国Thermo)，琼脂糖(美国Thermo)，抗体稀释液(杭州联科生物股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，TUNEL细胞凋亡试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，青链霉素(美国Sigma)，姜黄素粉(杭州默沙东生物制药有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma)，RNA提取试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，细胞总蛋白提取(碧云天生物技术有限公司)，PBS(上海欣百诺生物工程有限公司)，β-actin单克隆抗体(美国Bioworld)，β-catenin单克隆抗体(美国Bioworld)，GSK-3β单克隆抗体(美国Bioworld)，c-myc单克隆抗体(美国Bioworld)，辣根过氧化物标记的二抗(美国Bioworld)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将液氮罐中保存的食管癌细胞Eca-109取出，放置于37℃的水浴锅中融化，观察细胞融化后，移液枪吹打细胞混匀后，转移至15 ml离心管中，加入10 ml细胞培养液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基)悬浮细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入3 ml细胞培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中培养。观察细胞长满细胞瓶时，倒掉细胞培养液，加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞。倒置显微镜下观察细胞间隙变大时，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS洗涤细胞，加入适量细胞培养液接种于新的细胞瓶中，37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法观察细胞增殖情况培养至对数生长期的食管癌细胞Eca-109，胰蛋白酶消化后，PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入细胞生长液调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬浮液100 μl，37℃，5%CO2培养基中培养24 h。吸除培养液，加入不同浓度的姜黄素使终浓度为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L，同时设置空白组和阴性对照组，空白组中不加细胞加入等量的姜黄素，阴性对照组中加入等量的细胞生长液代替药物。为了提高实验结果的精确性，减小实验误差，每组设置10个复孔。放置于37℃，CO2培养箱中培养24、48、72 h。培养结束后加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，37℃孵育4 h。弃去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)溶液100 μl，37℃孵育震荡10 min。用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度(OD值)，每组实验数据取各孔的平均值，计算细胞的IC50和细胞抑制率，细胞抑制率=1-(药物作用组-空白组)/(对照细胞组-空白组)。

1.2.3 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡终浓度为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黄素与Eca-109细胞作用48 h后。加入4%多聚甲醛固定液放置于室温下固定细胞30 min，弃上清，PBS洗涤细胞3次，3 min/次，加入3%H2O2甲醇阻断内源性氧化物酶，孵育30 min，加入PBS洗片。加入含有0.1%TritonX-100的0.1%的枸橼酸钠溶液作为通透液，放置于冰盒中孵育2 min，小心吸除液体，加入转化剂过氧化物酶(POD)50 μl，盖上盖玻片，37℃于湿盒中反应30 min，洗片。加入100 μl二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色，室温静置15 min，用酒精脱水后，用二甲苯透明封片。同时设置对照组。显微镜下观察细胞核为棕红色为阳性，计算凋亡率。凋亡率的计算方法：胞核为红棕色的细胞数与总细胞数量的百分比。

1.2.4 RT-PCR检测细胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的表达食管癌细胞Eca-109经8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黄素作用48 h后，PBS洗涤细胞，加入适量的Trizol Reagent裂解食管癌细胞，用氯仿抽提，吸取水相层到新EP管中，加入异丙醇混匀，12 000 r/min离心15 min。用提前预冷的乙醇洗涤，放置于室温下风干，用RNAse free溶解RNA，保存于-80℃备用。用紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，OD260 nm/OD280 nm比值1.8～2.0认为RNA纯度很高。反转录系统合成β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。PCR扩增β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，凝胶系统成像。运用Image J分析目的基因表达率。

1.2.5 Western印迹检测药物作用后Eca-109细胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc表达取对数生长期的食管癌细胞Eca-109经胰蛋白酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，观察细胞贴壁后，弃细胞培养液，加入姜黄素终浓度为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的培养基，37℃，CO2培养箱中培养48 h。PBS洗涤2次，加入胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移到新的EP管中，PBS重悬细胞。按照细胞总蛋白提取试剂盒步骤提取细胞蛋白。按照蛋白浓度测定试剂盒操作步骤测定提取的蛋白浓度。在蛋白样品中加上样缓冲液混合后，煮沸变性5 min。每孔中加50 μl样品，电压80 V，marker进入分离胶后，将电压升高至120 V，电泳结束后将蛋白凝胶取出，滤纸、凝胶、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、滤纸依次夹好，4℃转膜过夜。取膜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗4℃过夜，TBST洗膜，加入二抗室温下孵育1.5 h。TBST洗膜后，显影，通过Odyssey扫描系统分析蛋白表达量。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞抑制情况作用时间为24、48、72 h的8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L浓度的姜黄素作用食管癌细胞Eca-109后的抑制率与对照组相比均差异显著(P<0.05)。姜黄素对食管癌Eca-109细胞的抑制作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加。计算姜黄素作用24 h IC50为28.1 μmol/L、48 h IC50为23.2 μmol/L、72 h IC50为15.6 μmol/L。见表1。

表1 MTT法检测姜黄素作用后食管癌Eca-109细胞的抑制率

与对照组比较:1)P<0.05

2.2 TUNEL检测姜黄素作用后的食管癌细胞凋亡情况姜黄素浓度为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L与细胞Eca-109作用48 h后，TUNEL检测细胞凋亡率分别为0.325 4±0.011 5，0.451 9±0.021 4，0.681 6±0.017 8，0.853 4±0.021 7。对照组的细胞凋亡率为0.056 5±0.002 7。各浓度姜黄素作用后的细胞Eca-109凋亡率与对照组相比均差异显著(P<0.05)。姜黄素可以促进食管癌Eca-109细胞凋亡。

2.3 RT-PCR检测药物作用后细胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的mRNA的表达 8、16、32、64 μmol/L姜黄素作用后β-catenin、GSK-3β、GSK-3β、c-myc的表达率与对照组相比差异显著(P<0.05)。姜黄素可以抑制食管癌细胞Eca-109中β-catenin、c-myc的转录，随着作用浓度的增加，抑制作用加强。姜黄素可以促进食管癌细胞Eca-109中GSK-3β的转录，随着作用浓度的增加，促进作用加强。见表2。

2.4 Western印迹检测β-catenin、GSK-3β、c-myc的表达各浓度姜黄素作用后的Eca-109细胞中β-catenin蛋白表达率、GSK-3β蛋白表达率、c-myc蛋白表达率与对照组相比差异显著(P<0.05)。姜黄素可以抑制β-catenin、c-myc蛋白的表达，且随着作用浓度的增加抑制作用增强。姜黄素可以促进GSK-3β蛋白的表达，且随着作用浓度的增加促进作用增强。见表3，图1。

表2 RT-PCR检测姜黄素作用后细胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc 表达率

与0 μmol/L比较：1)P<0.05；与0 μmol/L比较：2)P<0.01，下表同

表3 Western印迹检测药物作用后细胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表达率

图1 Western印迹检测药物作用后细胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表达

3 讨论

姜黄素是一种用从姜科植物中提取的植物色素。姜黄素的药用历史悠久，具有多种药用价值，在治疗胸胁刺痛、风湿引起的肩膀疼痛、闭经、跌打肿痛等方面疗效显著。另外姜黄素还可以调节血脂、消炎、抗纤维化、抗动脉硬化、预防癌症、治疗癌症。姜黄素有多种用途，在临床上也具有极高的应用价值〔5〕。由于姜黄素提取至植物中，副作用小，姜黄素的抗肿瘤功效越来越成为研究热点。研究表明，姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡等作用〔6〕。

细胞凋亡是一种正常情况下的细胞程序性死亡，受多基因调控〔7〕。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡是一种严格程序下细胞自我毁灭的死亡。细胞凋亡涉及一系列复杂的过程，受多种机制调控，与多种信号通路有关，受多种凋亡因子作用。正常情况下，细胞的增殖与凋亡处于动态平衡状态〔8〕。肿瘤的发生是肿瘤细胞增殖与凋亡平衡被打破造成的。研究表明，姜黄素可以通过作用于细胞线粒体，改变细胞线粒体膜通透性，细胞色素C趁机被释放而引起细胞凋亡〔9〕。另外，姜黄素可以促进凋亡基因Bax的表达，抑制Bcl-2转录而促进细胞凋亡。本研究显示药物作用后的食管癌Eca-109细胞增殖作用明显减弱，药物浓度越大，姜黄素抑制作用越明显，药物作用时间越长，姜黄素抑制作用也越明显。TUNEL结果显示，姜黄素可以促进食管癌Eca-109细胞凋亡。

Wnt信号通路与细胞的增殖分化有密切关系。Wnt信号通路是由跨膜蛋白(Fz)、Wnt、大肠腺瘤息蛋白(APC)、β-catenin等组成，这些蛋白分子将信号从细胞表面传递至细胞内。β-catenin的多少决定了Wnt信号通路开启还是关闭〔10〕。当细胞内β-catenin蛋白表达水平升高，Wnt信号通路开启，β-catenin蛋白表达水平降低，Wnt信号通路关闭。β-catenin蛋白的表达受相关因子的调控，GSK-3β、APC可以阻碍β-catenin蛋白作用，而散乱蛋白(Dishevelled)可以促进β-catenin蛋白的作用。正常情况下，细胞浆内的一部分β-catenin蛋白结合在细胞膜上，另一部分蛋白被GSB-3β、APC、Axin复合物降解。当Wnt蛋白与Frzzelds、LRP-5、LRP-6形成的跨膜受体结合，降解GSB-3β、APC、Axin形成的复合物，使β-catenin蛋白降解受阻。聚集在细胞质中的β-catenin蛋白受到相关转录因子作用进入细胞核，促进癌基因的恶性增殖。其中GSB-3β是细胞质中β-catenin升高的关键酶，可以负调控β-catenin蛋白〔11〕。c-myc是信号通路Wnt的一个靶基因，在细胞持续增殖过程中起重要作用，属于细胞核内的癌基因。当信号通路Wnt激活后，靶基因c-myc被激活，大量表达，细胞恶性增殖〔12〕。

本研究提示姜黄素可以抑制食管癌Eca-109细胞的增殖分化，通过干扰细胞周期，促进细胞凋亡。姜黄素能促进GSB-3β的表达而促进β-catenin降解，减少细胞中β-catenin的含量从而阻碍c-myc癌基因表达，干扰癌细胞的Wnt信号通路，抑制癌细胞增殖。

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