DNA分子定量技术研究

2017-03-24李博洋

中国科技纵横 2017年2期

关键词：定量

李博洋

摘要：核酸的序列、多样性和丰度分析是现代生物学的基础。DNA定量检测在肿瘤早期研究、产前检查、环境微生物分析、遗传病研究等方面具有广泛的应用前景。本文介绍了三种核酸定量技术，包括光度分析法、荧光定量PCR技术和数字PCR技术，系统阐述了各项技术的原理、特点及其应用，并对各方法的优缺点进行了比较，以供广大科研工作者在实际检测工作中借鉴和运用。

关键词：PCR技术；定量；DNA检测

中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）02-0255-02

DNA双螺旋结构的发现是20世纪最伟大的科学发现之一，标志着生物学研究进入了分子水平。1985年聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）被提出，极大程度地促进了DNA研究的发展。DNA分子定量检测作为生物学领域中一项基本的技术，具有广泛的应用前景，包括肿瘤早期研究、产前检查、环境微生物分析、遗传病研究等。目前，DNA分子定量测量技术主要包括荧光定量PCR技术、数字PCR技术以及光度分析法。

现将有关研究情况报告如下：

1 荧光定量PCR

1.1 荧光定量PCR原理

荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR）简称为qPCR，使目前运用最广泛的DNA定量技术。它的原理为：进行PCR扩增时，通过加入一个特殊的荧光探针，对PCR产物标记跟踪。每增加一条DNA序列，就会出现一个新的荧光分子，使荧光分子信号与PCR产物浓度形成一定关系，再利用相关软件分析，计算待测序列的初始数量。

理论上PCR的过程应该为指数增长，但实际上扩增曲线并不是标准的指数图像，而是S形曲线。原因是，当循环次数增加时，引物、Taq酶、DNA模板等浓度逐渐降低，PCR的效率随之下降，产物增长的速度也逐渐下降。当所有Taq酶饱和之后，PCR即进入平台期。不同的PCR反应由于各种因素的影响，难以精确控制其进入平台期的时间以及平台期高度。因此PCR实验的可重复性并不高，结果存在较大差异。

qPCR通过实时监测荧光信号来克服这一弊端。传统的qPCR认为在指数扩增的初始阶段，样品间的细小误差并未放大，可认作扩增效率恒定。达到阈值前循环次数记为CT（cycle threshold），对每个循环进行实时荧光检测。对于任一个PCR反应，到达循环阈值时有：

Nt=N0（1+ E）CT

其中，N0为初始模板的拷贝数，Nt为第CT个循环时产物的拷贝数，E为扩增效率。对于特定的PCR反应，CT个循环的拷贝数Nt和扩增效率E均为定值，因此CT仅由初始模板数量N0有关。由此可以得到初始DNA的数量。

1.2 荧光定量PCR特点

实时荧光定量PCR的发明，极大地简化了定量检测的过程，并实现了真正的绝对定量。这种技术保证了工作效率，反应迅速、灵敏度搞、可重复性强、特异性号，结果清晰。

荧光定量PCR也具有一定缺点：由于在PCR扩增的过程中，有很多因素可能会影响其扩增效率，例如引物浓度、温度、酶等，因此其扩增效率难以保持恒定，导致准确度下降。同时，由于qPCR的结果需要与校准物标准曲线进行对比，依赖外标，是一种相对定量的方法。

1.3 荧光定量PCR应用

目前主要的应用有：（1）临床疾病诊断及疗效评估，包括艾滋病、结核、各种肝炎等；优生优育检测，包括血友病、胎儿畸形、性别发育异常、地中海贫血等；肿瘤诊断，通过检测肿瘤标志物或部分肿瘤基因；遗传病检测。（2）动物疾病检测，包括口蹄疫、禽流感、猪瘟、炭疽芽孢杆菌等。（3）食品安全检测，包括食物过敏源、转基因、微生物等。（4）科学研究，在医学、生物学、农业等领域。

2 数字PCR

2.1 数字PCR原理

数字PCR（digital PCR），简称dPCR，是一项核酸定量检测的新技术。不同于传统的荧光定量PCR，该技术不依靠任何外标实现直接计数目标物。将样本稀释至达到单分子水平，平均分配到几十至几万个芯片微反应器中进行反应。这样的分配方式可以保证分子独立扩增，消除了本底信号的影响，提高了靶标扩增的灵敏度。扩增结束后采集每个反应单元的荧光信号，最后通过直接计数或者泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

PCR扩增结束后，记有荧光信号的单元为1，不含有荧光信号的单元为0，其中有荧光标记的反应单元里至少含有一个拷贝的目标分子。由于扩增前进行稀释，可以认为样品中目标DNA的浓度极低，有荧光标记的反应单元数等于目标分子的拷贝数。在一般情况下，各个反应单元中可能包含两个或以上的目标分子，所以采用泊松分布公式计算。

数字PCR的分辨率指的是对目标基因的识别能力，除了与监测设备的灵敏度、PCR的扩增效率有关之外，极大程度依赖于反应单元的数目n。理论上，每个反应单元最多存在一个拷贝的DNA分子，在相同体积的情况下，n=102时，该方法的最大分辨率为1/100，也就是说浓度高于1%的样本才可以被检测出来；当n=104时，浓度高于0.01%的样本就可以被检测出来。因此，反应单元的数目越多，数字PCR的灵敏度越高，准确度也越高

2.2 数字PCR設备

可以看出，dPCR技术对操作反应器的要求很高。在20世纪末期，主要使用96孔或384孔平板，然而加样操作的复杂性限制了测量准度和通量。2003年，Liu等首次采用微流体这一概念，实现了400个独立PCR反应，这一数字在2008年被提升至9180个。在最近的研究中，Heyries等发明了一个百万级别的微流体状体，实现了dPCR技术的再次突破。该装置通过表面张力控制样品分布情况，达到每皮升100万个反应。

dPCR具有很高的市场价值。2006年，美国Fluidigm公司率先推出第一款dPCR设备——BioMark系列高通量基因分析芯片系统。近年来，国内外的多家公司致力于研发更高通量和灵敏度的dPCR产品，反映出该新兴技术的巨大潜力。

2.3 数字PCR特点

数字PCR技术具有以下优点：操作方便、定量准确、特异性好、灵敏度高，在循环阈值CT难以分辨的情况下，具有不可代替性的作用。此外，dPCR还具有高通量性，能够同时并行地测定几十万到百万级别的DNA分子序列。

但是，dPCR也具有一定的局限性：尽管通量高，但上万反应单元往往针对同一样本，因此在普通的基因监测中并无突出优势。与此同时，数字PCR技术对设备要求高，高精密仪器和复杂芯片的运用使之价格昂贵，也因此制约了该项技术的普及。

2.4 数字PCR应用

在qPCR技术应用的基础上，dPCR技术在某些领域表现出其显著的卓越性：1）单细胞基因表达。由于dPCR技术具有高精度的优点，因此可以准确测量单细胞中的DNA序列。White等设计了一套dPCR设备，可用于捕捉单细胞并加工处理。Guo等采用该技术研究受精卵到囊胚水平的单细胞基因表达。2）环境微生物研究。dPCR技术的高通量性为同时研究多个细菌中多个基因提供帮助。例如Tadmor等利用该技术研究病毒宿主，发现不同的宿主间存在等位基因混合现象。3）单分子测序。Zernant等利用dPCR寻找ABCA4疾病的基因异常情况；Jones等通过验证先天性糖基化缺陷基因的序列，提供了先天性糖基化缺陷在分子水平的诊断手段。

3 光度分析法

组成DNA的碱基具有一定的吸光特性，根据核酸分子的吸光度可以定量计算DNA浓度。

DNA分子具有吸收250-280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm，吸光值记作OD260，因此一般采用紫外线作为光源。计算OD260与不同浓度DNA溶液之间的线性关系，比对标准值，即可得到结果。

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。此时荧光同时检测一批样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。

一般认定纯DNA为OD260/OD280≈1.8（>1.9，表明存在RNA污染；<1.6，表明存在蛋白质或酚类等污染）。若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用其他方法进行估算。这种方法操作简单，对设备要求低，一般应用于实验室。

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