热应激对猪睾丸Cyt-C和Caspase-3表达的影响

范小瑞，张禛，席华明，梁亚俊，贺俊平



热应激对猪睾丸Cyt-C和Caspase-3表达的影响

范小瑞，张禛，席华明，梁亚俊，贺俊平

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

【目的】环境高温影响猪精子发生和精液品质，但其分子机制尚不清楚。为此探索环境温度升高导致的热应激对猪睾丸细胞凋亡调节蛋白Cyt-C和Caspase-3表达的影响。【方法】性成熟长白公猪9头，对照组3头，饲养在20—27℃的猪舍环境；短期热应激处理组（heat stress 7 d，HS7d）3头，每天置37—40℃的猪舍环境3 h，连续7 d；一个精子发生周期热应激处理组（heat stress 42 d，HS42d）3头，每天置37—40℃的猪舍环境3 h，连续42 d；每天于热应激处理后将猪驱赶回20—27℃的猪舍。手术摘取睾丸组织，用QRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法检测Cyt-C和Caspase-3表达与定位的变化。【结果】 QPT-PCR结果显示，与对照组相比，热应激处理7 d组和42 d组，Cyt-C和Caspase-3mRNA的相对表达量均显著升高；热应激处理7 d组Cyt-C和Caspase-3mRNA的相对表达量最高。Western blot结果显示，热应激处理7 d组和42 d组Cyt-C和Caspase-3蛋白水平与对照组相比均显著升高；热应激处理7 d组Cyt-C和Caspase-3的蛋白表达水平最高。免疫组织化学研究发现，Cyt-C在猪睾丸组织中免疫反应阳性物定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞的胞质中，在生精细胞Cyt-C低表达于精原细胞，高表达于减数分裂后精母细胞和精子细胞。热应激处理导致Cyt-C的胞质内定位更加弥散，提示Cyt-C从线粒体到胞质的释放。Caspase-3在间质细胞和精原细胞低表达，大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性。与对照组相比，热应激处理导致部分支持细胞Caspase-3的表达，大量生精细胞的细胞核呈Caspase-3阳性着色。【结论】高温热应激处理导致猪睾丸Cyt-C和Caspase-3的蛋白和mRNA表达水平升高、细胞定位改变，提示Cyt-C和Caspase-3可能与热应激导致的猪精液品质下降存在关联。

热应激；公猪；睾丸；Cyt-C；Caspase-3

0 引言

【研究意义】高温热应激严重影响种猪性欲和精液品质，进而影响种猪繁殖率[1-3]。探明热应激损伤猪精子发生和精液品质的分子机制，并提出应对措施，对种猪繁殖实践具有重要意义。【前人研究进展】对热应激损伤实验动物小鼠[4]、大鼠[5-6]和猴[7]的精子发生分子机制的研究发现，部分原因是热应激诱导细胞凋亡，导致生殖细胞减少，进而导致少精症和无精症。细胞凋亡信号途径在进化中高度保守。蛋白酶Caspases（cysteine aspartic acid specific protease）家族成员在细胞凋亡调节中起重要作用。在哺乳动物细胞中，Caspases依赖的细胞凋亡主要由两条途径引发：由死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内源途径。细胞凋亡的内源途径中，线粒体细胞色素C（Cyt-C）从线粒体释放到胞质中是细胞凋亡内源信号途径的关键。Cyt-C释放到胞质中，与胞质的Apaf-1（apoptosis protease activating factor）分子结合，激活Caspase-9酶原，进而激活Caspase-3酶原，Caspase-3的活化，细胞凋亡将不可避免的发生[8-10]。热应激诱发细胞凋亡见于阴囊和睾丸局部受热[11]和精索静脉曲张[12]。用40℃或42℃温水浴处理小鼠睾丸30 min，Caspase-3表达增加，大量生精细胞死亡[13]。Caspase-3由细胞质进入细胞核是其发挥促凋亡作用所必需，但其机制尚不清[14]。另外，小鼠缺乏睾丸特异性Cyt-C，精子功能受损[15]。Cyt-C在生殖细胞和支持细胞数量比例的维持中也发挥着十分重要的作用[16-17]。Caspase-3基因敲除小鼠，Cyt-C的释放受到抑制，而活化的Caspase-3以正反馈的形式，进一步刺激Cyt-C向胞质的释放，进一步加速细胞凋亡[18]。【本研究切入点】高温影响猪精子发生和精液品质，但分子机制不清楚。来自其他哺乳动物的研究提示，细胞凋亡与凋亡调节蛋白在热应激损伤精子发生中起重要作用，细胞凋亡的调节机制研究认为线粒体细胞色素C释放到胞质中，并最终激活Caspase-3蛋白酶，起始细胞凋亡。热应激对这两种细胞凋亡调节蛋白在猪睾丸表达是否有影响，未见报道。【拟解决的关键问题】高温热应激条件下，用QRT-PCR法、Western blot法和免疫组织化学法研究热应激对性成熟猪睾丸Cyt-C和Caspase-3mRNA蛋白表达与组织细胞定位的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及处理

140 kg左右，14月龄，健康状况良好的性成熟长白公猪9头，饲养在20—27℃的猪舍环境；随机分成3组，其中3头，置37—40℃的猪舍环境，每天3 h，连续7 d，为短期热应激处理组（heat stress 7 d，HS7d）；3头置37—40℃的猪舍环境，每天3 h，连续42 d，为一个精子发生周期热应激处理组（heat stress 42 d，HS42d）；每天在热应激处理结束后，将猪驱赶回20—27℃的猪舍；其余3头猪整个试验期保留在20— 27℃的猪舍，为对照组（control，CON）。试验时间为2015年7、8月份，地点为太谷县某养殖场。热应激处理结束24 h，各组试验用猪，手术法摘取猪睾丸组织，将部分睾丸组织切成小块，迅速分装于冻存管，冻存于液氮，用于总RNA和总蛋白的提取。部分睾丸组织切成的小块，迅速置于Bouin氏固定液中，4℃冰箱固定12 h，后转入70%酒精，经脱水、透明、浸蜡，用于制作石蜡切片。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取和QPT-PCR的扩增 Trizol法提取总

RNA（Trizol Readent，Invitrogen公司产品），1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用ND-1000（NanDrop Technologies）测定其浓度。用QIAGEN公司反转录试剂盒进行cDNA合成，去除基因组DNA，反应体系为：gDNA Wipeout Buffer，7×：2 µL；总 RNA：1 µg；加至14 µL，体系混匀后置于PCR仪中，按条件：42℃ 2 min进行反应；cDNA合成，反应体系为：Quantiscript RT Buffer, 5×：4 µL；RT Primer Mix：1 µL；Reverse-transcription master mix：1 µL；Template RNA（Entire genomic DNA elimination reacton）：14 µL，体系混匀置于PCR仪中，按条件：42℃，30 min；95℃，3 min进行反应，-20℃保存cDNA。参照NCBI给出的Cyt-C和Caspase-3基因全序列中的CDS序列使用primer premier 5.0软件设计荧光定量RCR扩增引物，交由华大基因合成，引物见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列及扩增条件

用QIAGEN试剂盒（QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN公司产品）进行荧光定量PCR，18SrRNA作为内参基因与Cyt-C和Caspase-3共同进行扩增，每个样品重复3次，置于Stratagene Mx3005P 实时荧光定量PCR仪（Stratagene Agilent，USA）上反应。根据扩增曲线的CT值计算定量结果。通过2-ΔΔCT计算Cyt-C和Caspase-3在对照组和试验组猪睾丸中的相对表达水平。18SrRNA标准化Cyt-C和Caspase- 3mRNA的相对表达量。

1.2.2 Western blot 分析 用蛋白提取试剂盒（碧云天公司产品）提取睾丸组织总蛋白，用ND-1000测定蛋白质浓度。每空上样量为200 μg 蛋白样品，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳转移至硝酸纤维素（NC）膜；5%脱脂奶粉封闭1 h；TBST冲洗，加入第一抗体（多克隆兔抗Cyt-C，TBST1000倍稀释；多克隆兔抗Caspase-3，5%脱脂奶粉200倍稀释；单克隆兔抗GAPDH，TBST2500倍稀释；一抗均为Abcam公司产品）覆盖NC膜，室温放置30 min，4℃过夜；第2天取出，室温放置30 min，TBST冲洗10 min×3，加入山羊抗兔IgG抗体（TBST6000倍稀释，康为世纪公司产品），37℃孵育1 h，TBST冲洗5 min×6；加入高灵敏度发光试剂（康为世纪公司产品），胶片曝光。用ImageJ（National Institutes of Health，USA）进行分析。

1.2.3 免疫组织化学 石蜡切片经脱蜡至水，用新配置3% H2O237℃孵育10 min，以去除内源性过氧化物酶，PBS（PH7.4）冲洗3 min×3；正常山羊血清封闭液37℃孵育10 min；分别滴加第一抗体（多克隆兔抗Cyt-C，BSA1000倍稀释；多克隆兔抗Caspase-3，BSA100倍稀释，第一抗体均为Abcam公司产品），室温放置30 min，之后置4℃冰箱过夜；第2天取出，室温放置30 min，PBS冲洗3 min×3，滴加第二抗体（多聚化山羊抗兔IgG，康为世纪公司产品），37℃孵育30 min，PBS冲洗3 min×3；DAB（福州迈新生物技术开发有限公司产品）显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。棕红色着色判定为免疫反应阳性，根据阳性着色的深浅和范围，确定表达水平的高低。阴性对照切片，用正常非免疫兔血清代替第一抗体。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）与显著性检验，差异显著＜0.05，差异极显著＜0.01。所有实验数据以“平均值±标准误（mean±SEM）”表示。

2 结果

2.1 热应激对Cyt-C和Caspase-3 mRNA相对表达水平的影响

QRT-PCR研究显示，对照组Cyt-CmRNA的相对表达量为0.8340±0.0196，热应激处理7 d和42 d组Cyt-CmRNA的相对表达量升高，分别为2.1742± 0.1212、1.1254±0.0414，分别是对照组的2.61倍（＜0.01）、1.35倍（＜0.05）（图1-A）。对照组Caspase- 3mRNA的相对表达量为1.0068±0.1130，热应激处理7 d和42 d组Caspase-3 mRNA的相对表达量升高，分别为3.7975±0.3391、3.0010±0.5516，分别是对照组的3.77、2.99倍（＜0.01）（图1-B）。

A. Cyt-CmRNA相对表达量；B. Caspase-3mRNA相对表达量。CON：对照组；HS7 d：热应激7 d组；HS42 d：热应激42 d组。* P＜0.05; ** P＜0.01

2.2 热应激对Cyt-C和Caspase-3蛋白相对表达量的影响

Western blot研究显示，各试验猪睾丸组织提取物中存在分别与多克隆兔抗Cyt-C和多克隆兔抗Caspase-3进行免疫反应的阳性条带，分子量分别为12和32 kD（图2-A）。对照组Cyt-C蛋白水平相对表达量为0.4455±0.0644，热应激处理7 d和42 d组Cyt-C蛋白水平相对表达量升高，分别为0.9069± 0.0446、0.7332±0.0724，分别是对照组的2.04倍、1.65倍（＜0.01）（图2-B）。对照组Caspase-3蛋白水平相对表达量为0.1768±0.0308，热应激处理7 d和42 d组Caspase-3蛋白水平相对表达量升高，分别为0.5974±0.0390、0.3574±0.0742，分别是对照组的3.38倍（＜0.01）、2.02倍（＜0.05）（图2-C）。

2.3 免疫组织化学试验

2.3.1 Cyt-C在猪睾丸中免疫组织化学染色 Cyt-C

在猪睾丸组织中免疫反应阳性物（棕色着色）定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞的胞质中，在生精细胞Cyt-C低表达于精原细胞，高表达于减数分裂后精母细胞和精子细胞。与对照组相比，热处理（HS7d，HS42d）导致Cyt-C的胞质内定位更加弥散，鉴于线粒体为直径0.3—1.0 μm，长短1.5—3.0 μm大小的线状、颗粒状小体，更细小的弥散分布提示Cyt-C脱离线粒体进入细胞质定位。阴性对照切片，以正常非免疫兔血清代替一抗，未见特异性着色（图3）。

2.3.2 Caspase-3在猪睾丸中免疫组织化学染色 Caspase-3在各组睾丸的细胞定位大体相似，间质细胞和精原细胞低表达，大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性表达（棕色着色）。与对照组相比，热处理（HS7d，HS42d）导致部分支持细胞和管周肌样细胞Caspase-3阳性表达，大量圆形和长形精子细胞的细胞核呈Caspase-3阳性表达，Rs所指圆形为圆形精子细胞的细胞核（图4-F,J），Es所指椭圆形为长形精子细胞的细胞核（图4-G,K）。阴性对照切片，以正常非免疫兔血清代替一抗，未见特异性着色（图4）。

3 讨论

Caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子，以无活性的酶原形式存在于活细胞的胞质中[10]。Caspase-3在哺乳动物睾丸的表达有大量报道，Caspase-3表达于人类精子发生过程中各级生精细胞和支持细胞[19]；小鼠精子发生过程中的精原细胞和精母细胞[13,20]；大鼠精子发生过程中的精母细胞[21]；新生羊驼间质细胞和各级生精细胞[22]；鲶鱼精子细胞[23]；Caspase-3在各种动物睾丸生精细胞中的表达，提示Caspase-3与精子发生密切相关，但其机制尚不清楚。

本项研究中Caspase-3蛋白和mRNA表达水平在热应激处理（37℃ 3 h连续7 d和42 d）猪睾丸显著升高。短期热应激处理（7 d）导致Caspase-3蛋白和mRNA表达升高。这与 JIA等对猕猴[7]和大鼠[24]睾丸的研究结果相似。参照文献报道，野猪的精子发生周期为41 d，本项研究中连续42 d（一个精子发生周期）热处理组猪睾丸Caspase-3蛋白和mRNA的表达高于对照组，但较7 d热处理组降低，这一方面可能是由于细胞对热刺激一定程度的调整适应；另一方面，也提示细胞在长期热应激环境条件下，以凋亡信号途径应对不良环境刺激的能力降低。

本项研究Caspase-3免疫组织化学结果显示，Caspase-3低表达于间质细胞和精原细胞，大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性。与对照组相比，热处理导致部分支持细胞Caspase-3的表达，大量生精细胞的细胞核呈Caspase-3阳性着色（棕色）。先前的研究证实，Caspase-3以酶原的形式存在于正常细胞的胞质中，Caspase-3高表达于减数分裂以后生精细胞，提示减数分裂以后细胞易于接受凋亡信号的刺激，是当受到热应激刺激时容易发生凋亡的细胞类型，这一点在有关热应激诱导的细胞凋亡类型已有证实[19,25-26]。支持细胞是曲精小管内唯一与生精细胞接触的体细胞，为生精细胞的发育提供营养支持。热处理导致支持细胞Caspase-3的阳性表达，提示热应激处理可能导致支持细胞启动细胞凋亡途径，而这一点对精子发生的损失是不可逆的。Caspase-3由细胞质进入细胞核定位是其发挥促凋亡作用所必需[27]。本项研究中，热处理导致大量精子细胞表现细胞核Caspase-3阳性着色（棕色），提示精子细胞是易于发生细胞凋亡的主要细胞类型。

细胞色素C是一种水溶性蛋白，分子量约为12 kD，位于线粒体内膜，是电子传递链的重要组成部分。线粒体释放到胞浆中的Cyt-C可通过与Apaf-1（apoptosis protease activating factor）结合，激活Caspase-9，并进而活化Caspase-3，介导细胞凋亡。本项研究中，热应激处理导致Cyt-C蛋白和mRNA的表达升高，热应激处理7 d导致Cyt-C蛋白和mRNA的表达显著升高，这与JIA等对猕猴[7]和大鼠[24]睾丸Cyt-C的研究结果相似。热处理42 d组Cyt-C蛋白和mRNA的表达水平较对照组高，但低于7 d组，这提示短期热应激处理可能导致细胞代谢加快，细胞凋亡的倾向性升高；而长期热应激环境（一个精子发生周期），Cyt-C的高表达有所恢复，提示细胞对热应激有一定的调整能力，逐渐恢复到较低水平。

Cyt-C免疫组织化学定位显示，整个睾丸组织的各类细胞均有Cyt-C的表达，这与文献[16]的研究报道相似。本项研究发现不同细胞类型Cyt-C的表达量高低有明显差别，精原细胞Cyt-C的表达量小，而减数分裂后生精细胞Cyt-C的表达水平高；结合Cyt-C是线粒体内膜电子传递链的重要组分，Cyt-C表达水平的高低反映细胞代谢水平的高低；这就提示精原细胞代谢水平较低，对细胞凋亡信号的刺激反应弱；减数分裂以后生精细胞代谢水平高，对细胞凋亡信号的反应强。

对照组Cyt-C的表达呈现弥散颗粒状，提示Cyt-C局限在线粒体区域，Cyt-C高表达于精母细胞和精子细胞，说明精母细胞和精子细胞线粒体含量丰富，而精原细胞线粒体含量少。与对照组相比，热应激处理组Cyt-C的表达呈现出弥散细点状，提示Cyt-C有脱离线粒体进入细胞质定位的特征。

试验期间，热应激组猪在进入37—40℃的猪舍时，有烦躁不安、不愿进入热圈的反应，反复驱赶对试验结果也会产生一定影响，本结果实际反映了热应激及驱赶的综合应激效应。

综上所述，热应激处理导致线粒体的表达水平升高和向胞质的释放量增加，通过信号分子激活Caspase-3，使Caspase-3表达水平升高，在减数分裂后的生精细胞细胞核的定位增加，活化的Caspase-3进一步反馈性调节使Cyt-C向胞质的释放增加，活化的Caspase-3增加，影响精子发生，导致精液品质下降。

4 结论

热应激处理导致线粒体细胞色素C和Caspase-3在猪睾丸mRNA和蛋白表达水平的增加，在睾丸组织细胞定位发生变化：线粒体细胞色素C脱离线粒体进入细胞质定位，Caspase-3由细胞质进入细胞核定位，提示线粒体细胞色素C和Caspase-3可能与热应激导致的猪精液品质下降存在关联。

References

[1] SHARPE R M. Environmental/lifestyle effects on spermatogenesis., 2010, 365(1546):1697-1712.

[2] HANSEN P J. Effects of heat stress on mammalian reproduction., 2009, 364(1534):3341-3350.

[3] PEARCE S C, MANI V, WEBER T E, RHOADS R P, PATIENCE J F, BAUMGARD L H, GABLER N K. Heat stress and reduced plane of nutrition decreases intestinal integrity and function in pigs., 2013, 91(11):5183-5193.

[4] MERICO V, DE BARBOZA G D, VASCO C, PONCE R, RODRIGUEZ V, GARAGNA S, TOLOSA DE TALAMONI N. A mitochondrial mechanism is involved in apoptosis of Robertsonian mouse male germ cells., 2008, 135(6):797-804.

[5] SHIKONE T, BILLIG H, HSUEH A J. Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis., 1994, 51(5):865-872.

[6] IKEDA M, KODAMA H, FUKUDA J, SHIMIZU Y, MURATA M, KUMAGAI J, TANAKA T. Role of radical oxygen species in rat testicular germ cell apoptosis induced by heat stress., 1999, 61(2):393-399.

[7] JIA Y, HIKIM A P, LUE Y H, SWERDLOFF R S, VERA Y, ZHANG X S, HU Z Y, LI Y C, LIU Y X, WANG C. Signaling pathways for germ cell death in adult cynomolgus monkeys () induced by mild testicular hyperthermia and exogenous testosterone treatment., 2007, 77(1):83-92.

[8] TANG W, WANG W, ZHANG Y, LIU S, LIU Y, ZHENG D. Tumour necrosis factor‐related apoptosis‐inducing ligand (TRAIL)‐induced chemokine release in both TRAIL‐resistant and TRAIL‐sensitive cells via nuclear factor kappa B., 2009, 276(2):581-593.

[9] ROCCO D D, CERQUA C, GOFFRINI P, RUSSO G, PASTORE A, MELONI F, NICCHIA E, MORAES C T, PECCI A, SALVIATI L, SAVOIA A. Mutations of cytochrome c identified in patients with thrombocytopenia THC4 affect both apoptosis and cellular bioenergetics., 2014, 1842(2):269-274.

[10] VOUTSADAKIS I A. Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma., 2000, 39(2): 151-156.

[11] SINHA HIKIM A P, RAJAVASHISTH T B, SINHA HIKIM I, LUE Y, BONAVERA J J, LEUNG A, WANG C, SWERDLOFF R S. Significance of apoptosis in temporal and stage-specific loss of germ cells in the adult rat after gonadotropin deprivation., 1997, 57(5):1193-1201.

[12] GAROLLA A, TORINO M, MIOLA P, CARETTA N, PIZZOL D, MENEGAZZO M, BERTOLDO A, FORESTA C. Twenty-four-hour monitoring of scrotal temperature in obese men and men with a varicocele as a mirror of spermatogenic function., 2015, 30(5):1006-1013.

[13] PAUL C, TENG S, SAUNDERS P T K. A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death., 2009, 80(5): 913-919.

[14] CHANG H Y, YANG X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases., 2000, 64(4):821-846.

[15] NARISAWA S, HECHT N B, GOLDBERG E, BOATRIGHT K M, REED J C, MILLÁN J L. Testis-specific cytochrome c-null mice produce functional sperm but undergo early testicular atrophy., 2002, 22(15):5554-5562.

[16] RUCKER E B, DIERISSEAU P, WAGNER K U, GARRETT L, WYNSHAW-BORIS A, FLAWS J A, HENNIGHAUSEN L. Bcl-x and Bax regulate mouse primordial germ cell survival and apoptosis during embryogenesis., 2000, 14(7): 1038-1052.

[17] STALLOCK J, MOLYNEAUX K, SCHAIBLE K, KNUDSON C M, WYLIE C. The pro-apoptotic gene Bax is required for the death of ectopic primordial germ cells during their migration in the mouse embryo., 2003, 130(26):6589–6597.

[18] WANG C, YOULE R J. The role of mitochondria in apoptosis., 1999, 35(1):S307.

[19] KILIC S, LORTLAR N, BARDAKCI Y, OZDEMIR E, YUKSEL B, OZTURK U, BUDAK G, DOGAN M. Caspase-3 and VEGF immunopositivity in seminiferous tubule germ cells in cases of obstructive and non-obstructive azoospermia in smokers versus non-smokers., 2009, 26(1): 57-63.

[20] LI Y, CAO Y, WANG F, LI C. Scrotal heat induced the Nrf2-driven antioxidant response during oxidative stress and apoptosis in the mouse testis., 2014, 116(5):883-890.

[21] MORENO R D, LIZAMA C, URZÚA N, VERGARA S P, REYES J G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat., 2006, 325(3):533-540.

[22] 贺俊平, 姜俊兵, 董常生. 羊驼睾丸细胞凋亡及凋亡相关蛋白的定位. 畜牧兽医学报, 2009, 40(12):1799-1804.

HE J P, JIANG J B, DONG C S. Apoptosis and localization of apoptotic related protein in testis of alpaca., 2009, 40(12):1799-1804. (in Chinese)

[23] MCCLUSKY L M, PATRICK S, BARNHOORN I E, VAN DYK J C, DE JAGER C, BORNMAN M S. Immunohistochemical study of nuclear changes associated with male germ cell death and spermiogenesis., 2009, 40(4):287-299.

[24] JIA Y, CASTELLANOS J, WANG C, SINHA-HIKIM I, LUE Y, SWERDLOFF R S, SINHA-HIKIM A P. Mitogen-activated protein kinase signaling in male germ cell apoptosis in the rat., 2009, 80(4):771-780.

[25] LUE Y, HIKIM A P, WANG C, IM M, LEUNG A, SWERDLOFF R S. Testicular heat exposure enhances the suppression of spermatogenesis by testosterone in rats: the “two-hit” approach to male contraceptive development., 2000, 141(141):1414-1424.

[26] HENNING H, MASAL C, HERR A, WOLF K, URHAUSEN C, BEINEKE A, BEYERBACH M, KRAMER S, GÜNZEL-APEL A R. Effect of short-term scrotal hyperthermia on spermatological parameters, testicular blood flow and gonadal tissue in dogs., 2014, 49(1):145-157.

[27] MAZUMDER S, PLESCA D, ALMASAN A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis., 2008, 414:13-21.

（责任编辑 林鉴非）

Effect of Heat Stress on the Expression of Cyt-C and Caspase-3 in Boar Testis

FAN XiaoRui, ZHANG Zhen, XI HuaMing, LIANG YaJun, HE JunPing

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi）

【Objective】 Elevated ambient temperature has detrimental effects on sperm quality in mammalian species including pig. But the molecular mechanism has not yet well understood. The aims of present study were to investigate the effect of heat stress on the expression of Cyt-C and Caspase-3 in boar testis. 【Method】 Nine mature boars (Landrace, 18 months of age) were used in the study. Three boars were subjected to 37-40℃ for 3 h daily for 7 days (heat stress 7 d, HS7d). Three boars were subjected to 37-40℃ for 3 h daily for 42 days (heat stress 42 d, HS42d). Following daily heat treatment the boars were driven back to normal house (20-27℃). The other 3 boars were kept in the normal house as control group (20-27℃). All boars were castrated and the testes were harvested. Western blot, QRT-PCR, and immunohistochemistry were used to analyze the expression of Cyt-C and Caspase-3. 【Result】 QRT-PCR showed that mRNA expression of Cyt-C and Caspase-3 were all increased in HS7d group and HS42d group compared with the control. And the relative expression of Cyt-C and Caspase-3mRNA in HS7d group was the highest. Western blot showed that the protein expression of Cyt-C and Caspase-3 was all increased in HS7d and HS42d as well, compared with the control group. And the protein expression of Cyt-C and Caspase-3 in HS7d group was the highest. Immunohistochemistry found that Cyt-C localized in the cytoplasm of Leydig cells, Sertoli cells and all stages of germ cells. In spermatogonia, the Cyt-C expression was low, while in postmeiosis germ cells, the expression of Cyt-C was higher. Heat treatment resulted in a more diffuse cytoplasmic localization of Cyt-C, which suggested that Cyt-C was released from mitochondria to the cytoplasm. In Leydig cells and spermatogonia, the Caspase-3 expression was low. A large number of postmeiosis germ cells showed Caspase-3 positive immunoreactive staining. Heat stress resulted in some Sertoli cells Caspase-3 positive staining and Caspase-3 positive with nucleus staining increased.【Conclusion】Elevated ambient temperature induced the increase of the expression of Cyt-C and Caspase-3, and the changes of cellular location, which indicated that the expression change of Cyt-C and Caspase-3 may be associated with the sperm quality decrease induced by heat stress.

heat stress; boar; testis; Cyt-C; Caspase-3

2016-05-11；接受日期：2017-01-10

国家自然科学基金项目（31470124）

范小瑞，E-mail：m18404981554@163.com。 通信作者贺俊平，E-mail：dnhjp@163.com