基于纳米二氧化钛的光致电化学适体传感器

莫方静，李孟洁，柴雅琴，袁 若

（西南大学化学化工学院，重庆 400715）

0 前言

光致电化学(PEC)分析方法是基于光电化学现象而发展起来的[1]。它的原理可以简单表述为光电材料在接受不同波长的光照射时，电子获得能量，受到激发，通过电子调节机理将激发态电子转移至半导体电极的导带或是其它具有较低能量水平的能带上，由此产生光电流[2]。PEC分析方法恰恰是电化学发光(ECL)的逆过程，光被用于激发电极上的活性物质，而各种波长的单色光很好获得[3]。光生电流作为检测信号，这样比直接检测光的强度更具稳定性。PEC分析方法具有设备简单、成本低廉、易于微型化和集成化等优点。除此以外，PEC分析方法还具有令人满意的灵敏度。很多研究者已经开始了对PEC分析方法的研究。PEC分析方法在各个领域都显示出了广阔的应用前景，如生物分析、医药行业、环境监测、食品安全等[4]。

PEC分析方法运用范围广泛。就生物分析来说，PEC分析方法不愧为一种新兴的，有前途的方法[5]。在生物分析中，一般都运用PEC分析方法来构建一些高选择性的传感器，以此达到对目标物检测的目的。古丽加玛丽.艾尔肯等[6]研究了基于分子信标的光致电化学生物传感方法。济南大学的王衍虎等[5]利用PEC分析原理构建了小型化、低成本的自供能生物传感器，并用于分析测定。张晓茹等[7]研究得到了免标记的光致电化学凝血酶(TB)传感器。虽然科学家们对PEC分析方法进行了很多研究，但PEC分析方法的机理尚不十分明确。因此，对PEC分析方法做进一步的探究是很有必要的。

适体是一种寡核苷酸片段，它类似于抗体并同抗体一样能结合特定的目标分子。适体作为分子识别物质，具有很多优点，如：高特异性、高亲和力、分子量小、稳定性好、目标分子范围广、可体外筛选、可化学合成等[8]。将适体与生物传感器检测技术结合起来，便可研制出一系列适体传感器[9]。目前，研究者们对适体传感器表现出了浓厚的兴趣，研究最为普遍的有荧光适体传感器、电化学适体传感器等几种。相对于传统的传感器，适体传感器具有独特的优点，比如具有高的靶向性和特异性等。适体传感器在医药病理、食品药品、环境监测等领域有着广泛应用。贾飞等[10]研究了基于氧化石墨烯材料的食源性致病菌适体传感器；郭业民等[11]研究了测定牛奶中抗生素残留的适体传感器；李发兰等[12]进行了用于检测抗生素残留的适体传感器的研究。

纳米材料一般是指尺寸在1～100 nm间的粒子，纳米材料具有以下效应：(a)表面效应：纳米材料直径小，比表面积大，表面原子的活性高；(b)量子尺寸效应：当半导体纳米材料的载流子在每个方向均受限时，其费米能级附近的电子能级会由体相材料的连续能带过渡到分立结构的不连续的能级，在光学吸收谱上表现为从无结构的宽吸收过渡到具有结构的特征吸收；(c)小尺寸效应：当纳米材料的尺寸大小比传导电子的德布罗意波长更小或是相等时，周期性边界将被破坏，材料的各种物化特性将被改变；(d)宏观量子隧道效应：量子相干器件中的电荷以及磁通量、微粒的磁化强度可以穿越宏观系统中的能垒并产生变化[13]。纳米材料具有以上四种特殊的效应，因此在磁性材料、催化、电子材料、光学材料、医药及功能材料等方面具有广泛应用。

二氧化钛，分子式TiO2，是一种常温下不溶于水和无机酸、碱的白色粉末。二氧化钛是一种偏酸性的两性氧化物，其化学性质十分稳定，常温下与硫化氢、二氧化硫等均不发生反应，但二氧化钛却具有非常令人满意的光电活性和光催化性能[14]。纳米二氧化钛(TiO2NPs)是指三维结构中至少一维的尺寸在1～100 nm之间的二氧化钛。TiO2NPs具有表面活性高、分散性好、磁性强、光催化活性高、光电活性优良等特性[15]。由于具有以上优良的性质，TiO2NPs运用广泛。其中，在PEC分析方法中，TiO2NPs作为光电活性物质，对目标物的测定起到了重要作用。除此之外，TiO2NPs还在光催化、环境监测、食品安全、医药卫生和能源领域都有重要应用[16]。

凝血酶(TB)是一种丝氨酸蛋白质水解酶，能促进血液凝固，在凝血功能的调节上具有重要作用。凝血酶在癌症的病理探究、早期预防及后期治疗都有着十分重要的作用[17]。因此，设计一种准确、灵敏测定凝血酶浓度的传感器具有重大意义[18]。该论文根据PEC分析方法的原理，以准确、灵敏检测凝血酶浓度为目标，构建适体传感器。将纳米二氧化钛作为光电活性物质，利用其优异的光学性质和光电转换特性，得到相对较大并且稳定的光电流信号。加之将H2O2作为电子供体，使获得的光生电流信号具有持续性。从而保证了所构建适体传感器的准确度和灵敏度。实验结果表明，该适体传感器的PEC信号响应值与凝血酶浓度的对数成线性关系，线性范围为0.01 pmol/L～10 nmol/L，检测限为 3.33 fmol/L。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：光致电化学分析仪(荷兰IVIUMSTAT公司)，CHI660E型电化学工作站 (上海辰华仪器公司)，S-4800扫描电子显微镜 (SEM)(日本东京Hitachi公司)，FA-2004AFA/JA系列电子天平(Metter Toledo公司)，SB-80超声清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)，TGL-20M高速台式冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司)，移液枪(成都方舟科技开发公司)，三电极系统：玻碳电极(GCE，Φ＝4 mm)为工作电极、Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极为参比电极、铂丝为对电极。

试剂：钛酸四丁酯 (C16H36O4Ti)、无水乙醇(CH3CH2OH)、冰醋酸(CH3COOH)、盐酸(HCl)、氯金酸(HAuCl4)、过氧化氢(H2O2)、巯基己烷(HT)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、凝血酶(TB)、100 pmol/L 的 L-半胱氨酸(L-Cys)、100 pmol/L 癌胚抗原(CEA)、100 pmol/L 甲胎蛋白(AFP)，超纯水(18．2 MΩ·cm)由Millipore 水纯化系统制备，用 0．1 mol/L Na2HPO4、0．1 mol/L KH2PO4和 0．1 mol/L KCl混合制备 0．1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7．0)，用 20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、 1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2混合配制的 Tris-HCl缓冲溶液(pH7．4)，凝血酶适体链(TBA)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，具体序列号如下：

TBA:5′-NH2-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3′

1.2 纳米TiO2的制备

取25 mL钛酸四丁酯缓慢加入到8．75 mL乙醇中，搅拌10 min后形成黄色溶液A。将1 mL冰醋酸和2．5 mL超纯水加入到8．75 mL乙醇中，搅拌形成溶液B，再滴加HCl(调节至pH＜3)。将A以3 mL/min的速度滴入B中，随即搅拌30 min，再在40℃水浴中加热2 h，形成胶体溶液。将该胶体溶液置于60℃下干燥，即可获得纳米TiO2。再取0．2 g纳米二氧化钛(TiO2NPs)分散于10 mL水中，离心洗涤，超声成均一的溶液。

1.3 PEC适体传感器的构建

文章中所设计PEC适体传感器的构建过程如图 1。 首先，将玻碳电极(GCE)分别用 0．3 μm 和0．05 μm三氧化二铝(Al2O3)粉在麂皮上反复地打磨抛光，用超纯水冲洗界面，并依次用乙醇和超纯水连续超声清洗干净。随后，将10 μL TiO2NPs滴涂到上述玻碳电极(GCE)上，于37℃的烘箱中烘干成膜。然后将经TiO2修饰的电极置于1%的氯金酸溶液中，于-0．2 V恒电位下电化学沉积10 s，并用超纯水淌洗，随即在该电极上滴涂15 μL TBA孵育12～16 h。用超纯水淌洗，再在该电极上滴加10 μL HT，在室温下孵育40 min以封闭其非特异性结合位点，并将电极用超纯水淌洗。最后在电极上滴涂20 μL不同浓度的TB，常温放置40 min。

图1 PEC适体传感器制备过程示意图Fig．1 The schematic diagram of the preparation process of this PEC aptasensor

PEC 测量：在 5 mL PBS 缓冲溶液（0．1 mol/L，pH7．0）和 50 μL H2O2的混合溶液中，选择波长为460 nm的单色光进行PEC测量。激发光源由LED灯提供，在0．0 V电位下关-开-关10-20-10秒。

2 结果与讨论

2.1 纳米二氧化钛的SEM表征

制备好纳米二氧化钛后，经透射电子显微镜SEM照样(图2)。照样结果显示，制得的纳米二氧化钛成圆球状，粒径约为300 nm，结果表明圆球状纳米二氧化钛已被成功制备。

图2 纳米二氧化钛的SEM表征Fig．2 SEM characterization of TiO2NPs

2.2 PEC适体传感器制备过程的电化学表征

通过测定被修饰电极在浓度为5 mmol/L的铁氰化钾溶液中的循环伏安(CV)强度变化来表征电极的制备过程，如图3所示。a曲线是裸电极(GCE)的CV表征曲线，它表现为一对对称的氧化还原峰。由于二氧化钛纳米粒子的导电性不好，相对于裸电极来说，CV表征的信号会减弱 (b曲线)。由于金纳米粒子可以促进电子传递，所以当在电极上沉积纳米金后，CV表征的信号增强(c曲线)。但当凝血酶适体链TBA修饰到电极表面上时，TBA带负电，而氧化还原探针CN-也带负电，同种电荷相互排斥，所以CV表征的信号与c曲线相比减弱了(d曲线)。接着用HT封闭，HT不导电，且HT与电极表面非特异性吸附位点结合，进一步阻碍电子的传递，CV信号再次降低 (e曲线)。最后，将凝血酶孵育在电极表面时，凝血酶会与凝血酶适体链特异性结合，再次阻碍电子的传递，因此CV信号进一步减弱(f曲线)。结果表明，该适体传感器的每一步修饰过程都是成功的。

图3 PEC适体传感器制备过程的CV表征:(a)裸电极，(b)纳米二氧化钛/裸电极，(c)沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(d)凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(e)巯基己烷/凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(f)凝血酶/巯基己烷/凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极Fig.3 CV responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.3 PEC适体传感器制备过程的PEC表征

在 5 mL PBS缓冲溶液 (0.1 mol/L，pH7.0)和50 μL H2O2的混合溶液中进行光电流测量。激发光源由LED灯提供，选择波长为460 nm的单色光，在0.0 V电位下关-开-关10-20-10秒。在图4中，与裸电极(a曲线)的PEC响应信号相比，经纳米二氧化钛修饰的电极具有较高的PEC信号(b曲线)；镀金后，由于纳米金遮挡住了纳米二氧化钛，纳米二氧化钛接受光照的效率降低，PEC信号降低(c曲线)；通过Au-N键作用，将TBA成功地固载到Au修饰的电极上，PEC信号再次降低(d曲线)；经HT封闭住非特异性位点，PEC信号进一步降低(e曲线)；通过TB与TBA的特异性结合，将TB成功地固载到电极上，由于TB是一种蛋白，会阻碍电子的传递，因此PEC信号继续降低(f曲线)。

图4 适体传感器制备过程的PEC表征:(a)裸电极，(b)纳米二氧化钛/裸电极，(c)沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(d)凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(e)巯基己烷/凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极，(f)凝血酶/巯基己烷/凝血酶适体链/沉积金/纳米二氧化钛/裸电极Fig.4 PEC responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.4 光电流产生机理

光电流产生机理如图5所示。利用纳米二氧化钛作为光电活性物质，纳米二氧化钛因为其特殊的纳米结构而具有表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。纳米二氧化钛具有优异的光电活性，产生的光电流非常稳定。当光源的能量大于纳米二氧化钛的禁带宽度时，纳米二氧化钛价带上的电子获得能量、受到激发、跃迁到导带上，电子从导带上进一步转移到电极的表面，同时底液中的电子供体H2O2向纳米二氧化钛的价带提供电子，从而产生持续稳定的光电流信号。基于PEC分析方法原理，利用纳米二氧化钛优异的光电特性，构建了准确、灵敏的PEC适体传感器。通过检测PEC适体传感器对不同浓度TB的PEC响应值，从而达到检测TB浓度的目的。

图5 光电流产生机理Fig.5 The generating mechanism of photocurrent

2.5 适体传感器的PEC信号响应特性

采用标准直线法，用合理稀释过的待检测物凝血酶(TB)配置一系列不同浓度的样品作为目标物，以测得适体传感器对不同浓度凝血酶的光致电化学响应信号(图6)。从图6(A)中可以看到，适体传感器对目标物凝血酶的PEC响应值随凝血酶浓度的增加而降低，响应范围为0.01 pmol/L～10 nmol/L，检测限为3.33 fmol/L。表明基于半导体纳米二氧化钛的光致电化学适体传感器实现了对凝血酶TB的灵敏检测。图6(B)为线性范围内光致电化学峰电流值与lg cTB的线性相关图，其线性方程为I=-82.2048 lgc+567.1205，相关系数r=0.9397。

图6 适体传感器对不同浓度TB的PEC响应图(A)及校正曲线(B)(TB的浓度分别为:0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)Fig.6 PEC responses of different concentrations of target TB(A)and the corresponding calibration curve(the concentrations of target TB were 0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)

表1 PEC适体传感器同其他测定凝血酶的方法对比[19-21]Tab.1 The PEC captasensor compared with other thrombin analytical methods

此外，将所构建的PEC适体传感器的分析性能与其他检测凝血酶(TB)的分析方法的分析性能进行对比。如表1所示，该论文所构建的适体传感器具有相对较宽的线性范围和相对较低的检测限。这些结果进一步表明，该文所构建的适体传感器对TB的定量检测是可靠和灵敏的。

2.6 PEC适体传感器的稳定性

稳定性是检验一个传感器是否能得到实际应用的重要指标。一定浓度的待测物质在一定条件下的PEC信号是否稳定，通过多次测量PEC信号求取偏差来衡量。利用该适体传感器对浓度为100 pmol/L的凝血酶进行检测，得到的PEC响应信号的相对标准偏差(RSD)为0.63%(图7)。结果显示，该传感器具有较好的稳定性，有望用于实际样品的检测。

图7 PEC适体传感器的稳定性Fig.7 Stability of the PEC aptasensor

2.7 PEC适体传感器的选择性

为探索所构建适体传感器的选择性，该实验用L-Cys、CEA和AFP作为干扰物质。在控制条件相同的情况下，在传感器表面分别孵育L-Cys(100 pmol/L)，CEA(100 pmol/L)，AFP(100 pmol/L)和TB(10 pmol/L)。从图8可以看出，孵育L-Cys、CEA和AFP的传感器测得较高的PEC信号，并且与空白对照获得的PEC信号相差不大。而孵育TB的传感器测得较低的PEC信号，并且明显低于这三种干扰物质。结果表明，该适体传感器对凝血酶的检测具有良好的选择性。

图8 PEC适体传感器的选择性Fig.8 Selectivity of the PEC aptasensor

2.8 加标回收实验

为检验所构建的适体传感器在实际应用中的可行性。用稀释过50倍的健康人体血清分别配制以下浓度的凝血酶：5 nmol/L、1 nmol/L、20 pmol/L、5 pmol/L、0.1 pmol/L。 对样品进行检测，经过大量实验，最终得到的结果如表2。由表可知，回收率在93.60%~104.00%之间，表明所构建的适体传感器在健康人体血清中的检测效果良好，有望用于实际样品的检测。

表2 PEC适体传感器对不同浓度TB的检测Tab.2 Detection of different concentrations of TB by this PEC aptasensor

3 结论

文章旨在运用光致电化学分析技术构建一种准确灵敏的PEC适体传感器，用于凝血酶的检测。正是由于纳米二氧化钛的优良光电特性，获得了较高的PEC响应信号。由于凝血酶适体链TBA对凝血酶TB的特异性识别，该适体传感器具有良好的选择性。该适体传感器制备简单、检测灵敏、稳定性好、选择性高，提供了一种快速、准确测量凝血酶的检测方案。在实际样品中的检测显示，该适体传感器对凝血酶的检测有着较好的回收率，在临床诊断中有着广阔的发展前景和潜在的应用价值。

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