张家口市马铃薯脱毒种薯病毒检测试验研究

杨博文

（张家口市种子管理站，河北 张家口 075000）

张家口市马铃薯脱毒种薯病毒检测试验研究

杨博文

（张家口市种子管理站，河北 张家口 075000）

本试验应用酶联免疫吸附技术对36个马铃薯脱毒种苗样品进行PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒检测，未检测出PVX、PVS和PLRV病毒，表明这3种病毒脱毒情况良好；PVY病毒有1份样品检测结果呈阳性，需重点对PVY病毒进行监测，阻止带毒瓶苗进入生产，从源头上控制种薯质量。

马铃薯；脱毒种薯；病毒检测；试验

近年来，张家口地区马铃薯产业蓬勃发展，播种面积占河北省马铃薯面积的60%。由于大量使用脱毒种薯，全市马铃薯平均单产高达1.49 t/667 m2，高于全国单产0.968 t/667 m2。要保证脱毒种薯的质量，脱毒瓶苗的带毒率必须为0。

本试验应用酶联免疫吸附技术，对本市生产的马铃薯脱毒种苗进行检测，以了解本市各种薯企业马铃薯种薯脱毒情况，为马铃薯脱毒种薯质量监督提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

采用瑞士BIOREBA公司生产的马铃薯病毒检测试剂盒，包括马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。试验材料为本地主栽品种“荷兰十五”、“冀张薯12号”、“夏波蒂”、“布尔班克”等马铃薯脱毒瓶苗样品，共计36个。试验仪器包括酶标仪、微量移液器、恒温箱、离心机、冰箱等。

1.2 试验方法

①配置溶液，制备样品，提取缓冲液和洗涤缓冲液。②样品制备：将马铃薯种苗称重后放入样品袋并做好标记，每0.1 g加入1 mL提取缓冲液，研磨后离心取上清备用。③对照物准备：稀释阴阳对照物-20℃保存备用。④加样和对照物：将已包被好的酶标板取出，标注样品号（一个样品两个重复）和病毒名称，每孔加100 μL样品上清液。设置阴阳性对照孔，分别加入阴阳性溶液，然后装入封口膜37℃孵育3 h或4℃过夜。⑤制备酶标溶液，制备没标缓冲液，向酶标缓冲液中加入酶标抗体（IgG-AP）配制成酶标抗体溶液。⑥洗版，每孔加入200 μL洗涤缓冲液，浸泡1 min，倒空酶联板，立即在吸水纸上吸干残余液体。重复3～4次。⑦加酶标抗体，向每个样品孔中加入100 μL酶标抗体溶液。37℃下孵育2 h或4℃过夜。⑧洗版，方法同⑥。⑨制备底物溶液，准备底物缓冲液，将50 mg底物溶于5 mL底物缓冲液中。⑩显色反应，向每个样品孔中加底物溶液100 μL，为了保证显色时间一致，使用8道枪加液，然后将酶标板在20～25℃温度下避光孵育，5 min开始观察结果，20～60 min结果有效。结果判断：在OD 405/490读数，OD405/490≥2×阴性对照的样品判断为感染病毒。肉眼观察阳性对照和感病的样品为黄色记录为“＋”，颜色越深，病毒含量越高。

2 结果与分析

从表1可以看出，PVX阴性对照OD 405值为0.135，2倍OD 405值为0.270，所有样品检测值均小于0.270，无显色，未检测出PVX病毒；PVY阴性对照OD 405值为0.136，2倍OD 405值为0.272，样品QW 008检测值为0.485，大于0.272，显色黄色，确定样品QW 008检测出PVY病毒；PVS阴性对照OD 405值为0.138，2倍OD 405值为0.276，所有样品检测值均小于0.276，无显色，未检测出PVS病毒；PLRV阴性对照OD 405值为0.135，2倍OD 405值为0.270，所有样品检测值均小于0.270，无显色，未检测出PVX病毒。同时，4种病毒的阳性对照OD 405值远远大于2倍阴性对照OD 405值，并且明显显黄色，证明试验步骤正确，试验结果可信。

表1 瓶苗病毒检测结果

样品编号 显色PVX PVY PVS PLRV OD405OD405 显色OD405 显色OD405 显色QW005 QW006 QW007 QW008 QW009 QW010 QW011 QW012 QW013 QW014 QW015 QW016 QW017 QW018 QW019 QW020 QW021 QW022 QW023 QW024 QW025 QW026 QW027 QW028 QW029 QW030 QW031 QW032 QW033 QW034 QW035 QW036 0.134 0.136 0.134 0.139 0.133 0.139 0.133 0.131 0.132 0.135 0.130 0.134 0.130 0.140 0.131 0.140 0.136 0.138 0.134 0.133 0.134 0.132 0.136 0.132 0.132 0.132 0.133 0.131 0.135 0.136 0.129 0.141－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.141 0.136 0.132 0.485 0.136 0.141 0.141 0.135 0.137 0.141 0.138 0.142 0.133 0.136 0.132 0.133 0.130 0.133 0.130 0.140 0.136 0.130 0.131 0.140 0.138 0.132 0.137 0.130 0.141 0.137 0.130 0.137－－－＋－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.135 0.134 0.141 0.135 0.134 0.131 0.132 0.131 0.134 0.139 0.138 0.129 0.139 0.133 0.137 0.141 0.134 0.135 0.133 0.141 0.136 0.131 0.136 0.130 0.131 0.139 0.135 0.139 0.137 0.135 0.135 0.132－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－0.137 0.137 0.138 0.135 0.130 0.139 0.130 0.137 0.133 0.131 0.139 0.135 0.141 0.137 0.135 0.138 0.139 0.141 0.142 0.138 0.130 0.134 0.132 0.138 0.134 0.129 0.141 0.130 0.133 0.138 0.138 0.133－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

3 小结与讨论

检测发现，有1个样品感染PVY病毒。感染PVY会使马铃薯植株叶片斑驳黄化、卷曲、坏死，叶脉坏死，重型花叶，薯块退化变小，严重时减产50%。调查发现：该病毒是实验室茎尖剥离脱毒阶段残留的，种薯企业应提高生产技术水平，比如在茎尖剥离时尽量小，才能达到完全脱毒。同时，要阻止检测出带毒的马铃薯种苗进入下一步生产，从源头上控制马铃薯种薯质量，防止品种退化。

1005-2690（2017）02-0084-02

S435.32

B

2016-12-20）