柿果实水溶性提取物的抗氧化活性研究

王书珍++郑壮++张志伟++张明菊++李志良++向福++杨谷良

摘要：水果具有加快人体体能恢复、延缓衰老的作用。研究利用DPPH法测定罗田甜柿（Diospyros kaki）果实水溶性提取物的抗氧化能力，经优化的最佳反应条件为40 ℃反应15 min。1 g/mL的柿果实水溶性提取物相当于1.5 mg/mL维生素C的抗氧化效率。对比甜柿果实提取物3种水性溶剂的抗氧化效率，水提取物的抗氧化活性最高，Tris-HCl缓冲液提取物次之，PBS缓冲液提取物抗氧化活性相对较差。

关键词：罗田甜柿（Diospyros kaki）；水溶性提取物；DPPH法；抗氧化活性

中图分类号：S665.2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0542-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.038

Study on the Antioxidative Activity of Water-Soluble Extracts from Persimmon Fruit

WANG Shu-zhen，ZHENG Zhuang，ZHANG Zhi-wei，ZHANG Ming-ju，LI Zhi-liang，XIANG Fu，YANG Gu-liang

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains/College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，Hubei，China）

Abstract： Fruits play an important part in quickening energy recovery and slowing aging process. the antioxidant capacity of water-soluble extracts from fruits of Diospyros kaki was measured with DPPH method. Results showed that the optimal reaction condition was at 40 ℃ for 15 minutes. The antioxidative capacity of 1 g/mL water-soluble extracts from persimmon fruit was equal to that of 1.5 mg/mL vitamin C. Comparing the antioxidative capacity of H2O，PBS，and Tris-HCl aqueous solvents，the best one was H2O，while the least one was PBS.

Key words： Diospyros kaki； soluble extracts； DPPH method； antioxidative activity

自由基是生物机体氧化反应过程中产生的游离态有害化合物，其氧化活性能够引起动脉粥样硬化、心血管疾病、肿瘤等多种慢性疾病[1]。天然抗氧化剂是从动、植物产生的具有抗氧化活性的物质，如多酚类、黄酮类化合物、脂酸等[2]。抗氧化剂能中和生物体产生自由基，降低自由基对机体伤害的物质，是现代医药、食品保健行业研究的重点。

柿（Diospyros kaki）属柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros）落叶大乔木，主要分布在热带和亚热带地区。柿原产于中国，广泛分布于西北、华南、华北及西南等省区[3]。柿果实具有较高的食用和药用价值，并且叶、花、皮和根均可入药，特别是柿叶和柿果实的保健价值引起了人们的重视[4，5]。柿果实营养丰富，除碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿质元素外，还含有大量的氨基酸、萘醌类、黄酮类、萜类、鞣质、谷甾醇类、酚类、香豆素类、有机酸、胡萝卜素、维生素C等生理活性物质，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过敏、擴张血管等生理功能，柿子单宁能够有效抑制亚油酸的脂质过氧化过程[6-9]。

本研究对罗田甜柿果实水溶性提取物的抗氧化活性进行研究，探讨抗氧化的最优反应条件，为罗田甜柿抗氧化机制的阐述，天然抗氧化剂的开发、应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试验的罗田甜柿为自然成熟、新鲜无病害的果实，于2013年9月采自湖北省罗田县，置于自封袋，并放于冰盒中带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 样品及其处理方法 柿子先后用自来水、灭菌去离子水冲洗干净，去皮后取食用部分10 g，在研钵中按照1∶5的比例分别加入蒸馏水、PBS（0.1 mmol/L，pH 7.6）、Tris-HCl缓冲液（0.1 mmol/L，pH 7.2），研磨制备均匀液，6 000 r/min低温离心10 min，留取上清液即为柿果实水溶性活性组分，置于4 ℃冰箱中保存，48 h内用完。

1.2.2 最适浓度的筛选 利用柿果实水提取物进行试验，总体积为5 mL（2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液+3 mL不同浓度的柿果实水提取物）。6组反应体系内柿果实活性提取物浓度分别为0.015、0.030、0.045、0.060、0.075、0.090 g/mL。同时设置阴性对照组1，反应体系为2 mL DPPH溶液和3 mL灭菌H2O；以及阴性对照组2，反应体系为2 mL无水乙醇和3 mL相应浓度的柿果实水提取物。试验组和阴性对照组都重复3次。反应体系在37 ℃反应30 min，然后测定517 nm处的吸光度[10]，确定柿果实水提取物的最佳反应浓度。

1.2.3 最适反应温度的筛选 利用优化出的最佳反应浓度，设置6组相同的反应体系和2个阴性对照，分别在10、20、30、40、50、60 ℃条件下反应30 min，然后测定517 nm处的吸光度，确定柿果实水提取物的最佳反应温度。

1.2.4 最适反应时间的筛选 利用优化出的最佳反应浓度，设置8组相同的反应体系和2个阴性对照，在最佳反应温度条件下分别反应5、10、15、20、25、30、35、40 min，統计各反应时间段的自由基清除率，确定最佳反应时间。

1.2.5 最适缓冲液研究 利用蒸馏水、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液提取的柿果实提取物各3 mL与2 mL的DPPH在40 ℃条件下反应30 min，测定517 nm处的吸光度，确定柿果实提取物自由基清除效率最高的缓冲溶液。

1.2.6 柿果实提取物与维生素C的抗氧化活性比较 将0.066 7 g/mL的柿子果实提取物3 mL与 2 mL的0.2 mmol/L的DPPH在40 ℃反应15 min，统计自由基清除率。配制浓度为2 mg/mL的维生素C溶液，按照5 mL的反应体系设置4组试验，维生素C的终浓度分别为0.100 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/mL，40 ℃反应15 min，计算维生素C的自由基清除效率，并与柿果实提取物对DPPH自由基清除率进行比较。

2 结果与分析

2.1 最适浓度的筛选

在对DPPH自由基的清除过程中，随着柿果实水溶性提取物浓度的增高，自由基清除率逐渐提高，即抗氧化能力是浓度依赖性方式进行的（图1）。在0.015 g/mL处理组内，自由基清除率仅46.11%。0.030 g/mL和0.045 g/mL处理组内的自由基清除率分别是55.99%和65.57%。当柿果实提取物浓度增大到0.060 g/mL时，自由基清除率达到73.63%，比0.045 g/mL处理组自由基清除率增加了12.29%。然而，当浓度再增加到0.075 g/mL和0.090 g/mL时，自由基清除率增幅较小，分别为79.63%和82.15%。

当反应浓度从0.060 g/mL再增加时，反应进入平台期，自由基清除率虽然也在增高，但是增幅降低。在6组浓度不同的试验组内，以0.060 g/mL的反应体系效率最高，因此在后续的酶学参数分析中，以浓度为0.060 g/mL的柿果实提取物溶液作为检测标准。

2.2 最适反应温度的筛选

在柿果实浓度一致的情况下，随着反应温度的不同，自由基清除率随之而变化（图2）。在温度为10～40 ℃，随着温度的升高，体系的吸光度降低，自由基清除效率逐渐提高。在40～60 ℃的温度区间内，温度升高，反应体系的吸光度有所升高，即自由基清除效率逐渐降低。反应温度为40 ℃左右时，柿水溶性提取物具有相对于其他反应温度较高的清除DPPH自由基的能力，即抗氧化能力以40 ℃左右最强。

2.3 最适反应时间的筛选

在柿果实提取物浓度和反应温度相同的条件下，随着反应进程的进行，检测自由基清除率的变化（图3）。在反应时间为5～15 min随着反应时间的延长，反应体系的吸光度降低，自由基清除率逐渐增高。在15～40 min反应时间内，反应时间延长，反应体系的吸光度基本不变，自由基清除率维持在84.5%左右。即在15 min的反应时间内，柿果实的提取物的抗氧化能力最强。继续延长反应时间，对自由基的清除效率保持不变。因此，柿果实的抗氧化反应在15 min时间内效果最好。

2.4 缓冲液对自由基清除率的影响

在Tris-HCl缓冲液、蒸馏水、PBS缓冲液作为提取液时，水提取物的自由基清除效率最高，达到83.39%（图4）。自由基清除效率最差的提取液为PBS缓冲液，仅为33.73%。Tris-HCl作为提取液时DPPH自由基清除率为55.89%，比水提取液低，但是高于PBS缓冲液。浓度为1 g/mL的柿果实水溶性提取物的自由基清除率相当于质量浓度1.5 mg/mL维生素C的自由基清除率，即抗氧化能力相当。

3 讨论

杨继涛等[11]把柿果实中抗氧化物质进行了成分分析以及含量测定，对不同基因型柿果实中抗氧化物成分进行测定，包括总酚、总黄酮、总黄烷醇及VC等，发现不同基因型柿果实之间总酚、总黄酮、总黄烷醇及VC含量区别很大，野生种君迁子的总酚、总黄酮、总黄烷醇及VC含量明显高于栽培种的含量，并且抗氧化活性物质总酚、总黄酮及总黄烷醇的含量与抗氧化能力间的相关性均达到显著性差异（TBARS和HRSA除外），并认为柿果实中所含有的多酚类物质是柿果实抗氧化作用的重要因子之一。

2，4-二硝基苯肼和DPPH均为测定醛、酮类的显色剂，二者都可以用来评价抗氧化能力。郭豫等[12]曾用改良过的2，4-二硝基苯肼比色法来评价抗氧化保健食品中蛋白质羰基含量。本次试验用DPPH对柿果实水溶性提取物的抗氧化活性进行了定性分析，对其最佳反应条件进行了筛选，发现柿果实水溶性提取物具有较好地清除DPPH自由基能力，其达到最大抗氧化活性的反应温度为40 ℃，反应时间为15 min，这一情况与张惠婷等[13]的研究也比较符合。

柿子营养丰富，含有大量的糖类、多种维生素，具有较高的药用价值和经济价值。在甜柿功能产品开发方面，林娇芬等[14]、周鑫堂等[15]研究发现柿叶具有抗氧化、降糖、抗肿瘤、调血脂、止血等药理作用。关于柿皮，王继之[16]对其中的有效成分进行提取，而陈湘宁等[17]将柿皮与柿肉中抗氧化活性物质进行了研究与对比。本研究可为柿子抗氧化分子机制研究提供理论依据，也为改善柿子品种特质，开发柿子相关的功能食品提供参考。

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