基质效应在生物样品质谱分析中的优化措施研究

吴文静

（安徽公安职业学院 公安科学技术系，安徽合肥230031）

高效液相色谱－质谱联用法（液相质谱，HPLC－MS／MS）是一种高灵敏度和高选择性的样品定量分析方法，由于其高效样品的选择性和准确的测定能力而被广泛推广应用于食品相关检测、环境风险评估、农药残留分析、药物组分以及代谢研究中［1－2］。近几年，随着液质技术的快速发展，与检测相关的基质效应问题也开始被广泛关注。基质效应作为质谱检测中存在的必然问题，对样品检测、分析方法和结果的特异性、灵敏度和准确度都有显著影响［3］。目前，国外的学者已经开展了大量的与基质效应相关的工作和研究，但国内相关的研究还未能构成完整的研究体系。本文结合国内外相关文献，对液质检测过程中基质效应的产生原因、相关作用以及目前常规的检测方法和消除或降低基质干扰的途径等问题进行阐述。

1 基质效应产生机制及影响

基质效应指的是在样品检测过程中，除待测组分以外的其它物质对待测组分的分析进程产生的干扰，并影响检测结果的灵敏度和准确性。基质效应的产生主要是源于样品中的待测组分与基质成分在离子化过程中的竞争。由于分析物中组分的共流出效应，雾滴表面的离子化效率会受到影响，其结果会导致离子抑制或离子增强，并最终显著影响待测组分中目标离子的生成效率及检测强度。

基质效应最初是在1993年由Tang［4］提出的，他在研究中发现分析物的响应值在标准溶液中和生物基质中有较大的差异，并通过试验根据其响应值的增强和减弱结果提出了离子抑制和离子增强。Tang和Kar⁃le等人［2］在后续的研究中发现，基质效应的产生，其主要原因是由于待测组分与基质中非挥发性组分之间的竞争所导致。基质中非挥发性组分能够牢牢的吸附样品雾滴，阻止其进一步分裂为微滴。进一步推断竞争的形式，一种为蒸发过程中气态离子形成进程的竞争，另一种则是雾滴表面带电离子间的竞争。总的来说，基质效应与进入电喷雾离子源的基质多少密切相关。

2 基质效应的检测及评定

近些年来，随着HPLC技术在不同行业中的广泛应用，基质效应评估的必要性也越来越显著。国家食品药品监督管理局（SFDA）规定，以电离质谱为基础的食品、药品相关检测法中，需要依据样品的不同有针对性的考虑检测进程中的基质效应。但对于采用何种方法评估相关基质效应，并没有做出明确的规定。目前国内外关于基质效应的评定主要存在两种基本的检测方法，一种是1999年Bonfigjio［5］等人提出的柱后注射法；另一种是Matuszewski［6］等人提出的先提取后添加法。这种方法通过对信号峰面积平均值的测量，比较待测液中加入空白提取液的响应值与在纯溶液中加入待测物的响应值最终来确定基质效应的高低。

2.1 柱后注射法

如图1所示，柱后注射法这种基质效应检测方法是在分析柱与质谱仪之间，使用泵和分流器将待测样品通过稳定的流速注入到质谱仪中，质谱注入样品后会生成稳定的响应基线。而空白基质组分则会通过液相色谱注入，并经由色谱分析柱的保留时间后，与待测样品组分共同注入质谱仪中，并通过质谱分析仪检测对应的响应基线。响应基线中发生明显波动变化的区域则被认定为存在有基质效应的干扰。当待测样品的保留时间与响应基线的波动范围一致时，其质谱响应值也会随波动的程度而发生改变，从而影响试验结果的精密性和准确度。该方法是现阶段定性基质效应最为常用的方法，通过对基线波动时间和 出峰时间的比较，优化待测物质的保留时间，尽量确保出峰时间与基线波动（基质干扰）区域不同。

2.2 提取后添加法

提取后添加法是利用构建数学模型的方法评定基质效应。该方法是近些年来LC－MS／MS检测中最为常见的基质评定办法。根据此方法基质效应被划分为相对基质效应和绝对基质效应。相对基质是空白基质来自于不同个体样品间效应的比较，而绝对基质是指来自于一个个体的空白基质。简而言之，提取后添加法利用质谱检测三个不同条件下峰信号，并计算出峰面积平均值。其中，设定Al为标准品溶液；A2为样品基质提取后添加溶液；A3为样品基质提取前添加溶液，则基质效应（Matrix effect，ME）＝A2／A1；回收效率（Recovery efficiency， RE） ＝A3／A2；进程效率（Process efficiency， PE） ＝A3／A1。 这种检测方法能够较为客观、全面地评估基质效应的发生情况。目前对于基质效应的评估是以不同个体间基质变异系数为标准，该标准中规定6个不同个体基质间的基质效应变异系数不应大于或超过15%，若变异系数大于或超过15%则必须对相关的检测步骤进行有效的优化，从而确保降低检测过程中基质干扰效果。最近，一种利用标准曲线评估基质效应的新方法被提出［7］，该方法通过分别测定5个不同个体的基质样品，并逐一绘制标准曲线，利用计算5条标准曲线间斜率的偏差值，进而确定基质效应对定量的影响，若相对标准偏差＜4%，则认定该检测方法不受到基质效应影响。

图1 柱后注射法示意图

3 基质效应的降低和消除

一般来说，HPLC－MS／MS检测分析时基质效应是必然存在的，并随检测样品性质的不同而不同。因此如何减弱和消除待测样品中基质效应问题对于检测结果的客观和准确是尤为重要的。研究表明影响基质效应的因素有很多，如样品类型、样品前处理过程、色谱条件、质谱条件、流动相和离子源的选择等，故基质干扰的降低和消除需从多个方面考虑和分析。

3.1 样品前处理的优化

选择合适的样品制备方法是最有效的消除基质效应影响的途径之一。待测组分常需要尝试不同的样品前处理方法以达到最小的基质干扰和较高的回收效率。样品前处理一般可以被分为离线处理和在线处理两种。最常采用的离线样品处理方法有固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）、蛋白沉淀（PPT）等。Mullter等人［8］对SPE、PP、LLE以及PP与SPE相结合的四种样品制备方法的基质效应进行了比较研究。结果表明，在这四种样品前处理方法中，LLE法离子抑制作用最小，基质效应最低。目前在线样品处理较为常见的有阀切换、二维液相色谱－质谱、在线SPE等方法。其中二维液相色谱－质谱技术是利用柱体反冲去除复杂样品中的基质组分。阀切换方法通过把基质作为废液并在待测组分注入前后分别排出，进而使基质组分对结果的影响显著减少。而在线SPE是最近几年发展出的一种有效、快速的样品前处理方法。总体来说，待测样品前处理的目的是为了去除干扰物质，从而达到减少样品中基质干扰。但由于样品处理过程中会或多或少地导致待测组分的损失，因此在样品前处理中方法的选择必须要保证降低基质效应的同时兼顾提取回收率。并且最为关键的一点，无论是采用离线或在线的前处理方法，都不能简单地归结某种方法一定会优于另一种。这是由于不同种的分析物对基质效应的敏感性都不相同，因此其最佳的样品前处理方法也不尽相同。对于不同的待测组分，则需进行相应的试验来确定何种方法为基质干扰最小的样品前处理方法。

3.2 色谱条件的优化

筛选色谱条件是最为简便分离待测组分中基质干扰物质维持原样。样品在色谱分离时，最先被分离出的主要是基质中的极性成分。而这些极性成分是诱发基质干扰的主要原因。目前的研究发现，当目标分析物在色谱内的处理时间相对较短时（小于3分钟），基质干扰较为明显。而适当的延长色谱处理时间则会显著地降低待测组分的基质效应。而对于复杂的多组分物质检测，多种组间成分其色谱分离效果越好，则相应的基质影响也越小。总体来说，选择一个较为合适的色谱分离方式是降低组分检测中基质干扰的有效途径。Djkmana等人［9］以水体中的除草剂为分析目标，比较在单柱、柱前切换和双柱三种色谱分离模式下的基质干扰情况。结果发现，采用单柱组分测定时基质干扰效果最为明显，而柱前切换和双柱则可以很有效的避免该问题，尤其在双柱模式下，基质效应的消除非常显著。另外Choi等人［10］的研究中发现，进样体积对检测器的响应信号有显著影响，随着进样体积的不断增加，检测器的响应信号强度显著降低。因此在确保检测灵敏度的条件下，尽量采用较低的样品进样量可以适当避免基质效应的干扰。除此之外，色谱流动相的pH值的变化也同样会影响组分中分离物效果。Zhang［11］的试验中通过改变流动相pH值的方法将待测物与内源性物相分离，从而达到降低溶液中基质干扰的目的。如图2所示，在流动相pH＝7.0的色谱条件下，由于同位素效应，待测物和同位素内标保留时间产生了相应的漂移，导致待测物和同位素内标处于不同的离子抑制区，从而导致基质对待测物和内标产生抑制作用。相应的当流动相pH被降低到3.4时，待测物和同位素内标同时避开离子抑制区，并且保留时间也基本一致，这表明，pH的改变能够有效地消除基质对待测物的干扰。

3.3 质谱条件的优化

研究发现，基质效应会随着质谱中离子源、离子化模式的不同而产生不同的影响。因此修正质谱分析是有效降低基质干扰的途径之一，其优点是无需改变样品的前处理进程和色谱分析条件。HPLC－MS／MS质谱中ESI和APCI等都是最为常见的离子源，过去的研究中发现离子化模式同样会受到样品中基质效应的干扰。Kelly等人［12］利用ESI和APCI离子源对胎便中苯丙胺的离子化程度进行了相关检测，检测结果表明ESI较APCI更易受到待测样品中基质效应的干扰，且不同的电离方式对于化合物中负离子电离特异性影响也略有不同，ESI对于检测组分的离子抑制性更为明显。这与之前Dams等人［13］采用柱后注射法对比APCI和ESI两种电离模式对吗啡的离子抑制情况的研究结果相一致。现有的研究表明，基质效应主要对ESI电离模式有较为显著的干扰。因而，若采用ESI电离时，伴随显著基质效应，可考虑采用APCI模式，但在改变电离模式的同时，需对待测组分中相关的基质效应进行重新的评价。

3.4 同位素内标的选择

在HPLC－MS／MS检测中，由于待测样品组分复杂，处理过程繁琐，为确保检测结果的精密性和可靠性通常会使用内标来校正试验进程中的误差。理想的组分内标应当对待测组分的提取、检测过程无干扰，并在包括样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中拥有与待测组分相似的应答反应。因此一个合理且稳定的内标是消除基质干扰的有效途径。

表1 同位素氘代内标和同系物内标基质效应比较

目前的研究发现，稳定同位素内标是液质检测中最为稳定和安全的内标物，稳定同位素内标与传统的同系物内标相比，与分析物的理化性质更为相似，结构也更为稳定，且无论是在前处理过程还是在色谱分离、离子化以及质谱检测中，同位素内标与分析物的反应基本一致，因此这大大降低了待测组分中的基质干扰。

Sean等人［14］在定量分析西罗莫司药物效果的试验中，对采用同位素氘代内标和同系物内标的不同试验样品发生基质效应的情况进行比较（如表1）。试验采用人的空白全血，评估血液在高、中、低不同浓度药物刺激下的基质干扰情况。结果表明，氘代标记物和同系物分别作为待测组分内标时，标准曲线斜率的变异系数分别为1.8%和5.4%，待测组分相对基质效应分别为4.2%和8.9%；与同位素氘代内标相比，同系物基质效应较高，变异系数较大。这表明同位素氘代内标与传统的同系物内标相比能够更好地稳定溶液环境对样品的影响，降低组分中基质效应对检测结果的干扰。这与Antignac等人［15］对20个动物组织样品进行比较研究中发现的结果相一致，即使用同位素内标物醋酸曲安缩松较使用氟氢可的松作内标时信号强度的相对标准偏差显著降低。

4 结论

基质效应是生物样品质谱分析过程中重要的影响因素，在建立相关的质谱检测方法时应对样品中的基质效应进行相应的评估，并通过综合考量待测样品前处理进程、色谱分离条件、质谱检测和内标物的影响等方面，尽可能地降低或消除待测组分测定中的基质干扰，从而确保检测分析结果的精密性和可靠性。

［1］ Tang L，Kebarle P.From ions in solution to ions in the gas phase － the mechanism of electrospray mass spectrometry［J］.Analytical Chemistry，2008， 65（22）：972 －986.

［2］ Wu Y， Farrell J T， Lynn K， et al.The importance of chromatographic separation in LC／MS／MS quantitation of drugs in biological fluids： detec⁃tion， characterization， and synthesis of a previously unknown low － level nitrone metabolite of a substance P antagonist［J］.Analytical Chemistry，2003， 75（3）：426 －34.

［3］ Choi B K， Hercules D M， Gusev A I.LC － MS／MS signal suppression effects in the analysis of pesticides in complex environmental matrices［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2001， 369（3）：370 －377.

［4］ Tang L， KebarleP.Dependence of ion intensity in electrospray mass spectrometry on the concentration of the analytes in the electrosprayedsolution［J］.AnalChem，1993，65 （24）：3654 –3668.

［5］ Bonfiglio R， King R C， Olah T V， et al.The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm， 1999， 13（12）：1175.

［6］ Matuszewski BK，Constanzer ML，Chavez CM.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLCMS／MS ［J］.Anal Chem，2003 Jul 1；75（13）：3019 －3030.

［7］ Shi J W.Assessment of Matrix Effect in LC －MS／MS Quantitative Analysis with External Standard Method［J］.Physical Testing＆ Chemical Anal⁃ysis， 2012.

［8］ Müller C，Sch？ fer P，St？ rtzel M， et al.Ion suppression effects in liquid chromatography－electrospray－ionisation transport－region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries.［J］.Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical＆ Life Sciences， 2002， 773（1）：47 －52.

［9］ PascoeR， et al.Reduction in Matrix－Related Signal Suppression Effects in Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using On－Line Two－Di⁃mensional Liquid Chromatography［J］.Analytical Chemistry， 2001， 73（24）：6014.

［10］ Choi B K，Hercules D M，Gusev A I.Effect of liquid chromatography separation of complex matrices on liquid chromatography– tandem mass spectrometry signal supression［J］.Journal of Chromatography ， 2001， 907（1 －2）：337.

［11］ Zhang G， Wujcik C E.Overcoming ionization effects through chromatography： A case study for the ESI－LC – MS／MS quantitation of a hydro⁃phobic therapeutic agent in human serum using a stable－label internal standard［J］.Journal of Chromatography B， 2009， 877（22）：2003.

［12］ Vandelli D， Palazzoli F， Verri P， et al.Development and validation of a liquid chromatography－tandem mass spectrometric assay for quantitative analyses of triptans in hair［J］.Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical＆ Life Sciences， 2016， 1017 –1018：136－144.

［13］ Dams R， Huestis M A，Lambert W E， et al.Matrix effect in bio－analysis of illicit drugs with LC －MS／MS： Influence of ionization type，sample preparation， and biofluid［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry， 2003， 14（11）：1290 －1294.

［14］ Sean O H，Kennth F L .Evaluation of a deuterium－labeled internal standard for the measurement of sirolimus by high－throughput HPLC elec⁃trospray ionization tandem mass spectrometry.［J］.Clinical Chemistry， 2008， 54（8）：1386 －1389.

［15］ Antignac J P， Wasch K D， Monteau F， et al.The ion suppression phenomenon in liquid chromatography – mass spectrometry and its conse⁃quences in the field of residue analysis［J］.AnalyticaChimicaActa， 2005， 529（1 – 2）：129 －136.