藏药波棱瓜子总木脂素对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用及机制探讨

刘伟+符小红+黄思远+石晏丞+石林琳+顾健

[摘要]該实验探讨藏药波棱瓜子总木脂素对四氯化碳（CCl4）致大鼠肝纤维化的保护作用及其作用机制。将SD大鼠48只随机分为空白对照组、模型组、总木脂素低、中、高剂量（100，200，400 mg·kg^-1）组、阳性药甘利欣（25 mg·kg^-1）组，每组8只。空白组正常饲养，模型组、总木脂素低、中、高剂量组以及甘利欣组大鼠均隔2～3 d皮下注射3 mL·kg^-1含40%CCl4的橄榄油溶液连续造模8周。期间空白组、模型组灌胃等量生理盐水2 mL，总木脂素低、中、高剂量组、甘利欣组灌胃给药相应剂量。8周后最后一次造模6 d后处死大鼠。生化分析法测定各组大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）含量。ELISA法检测血清肝纤维化指标转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、透明质酸（HA）、羟脯氨酸（HYP）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，肝组织进行HE和Masson胶原染色，进行病理分析并评分。结果显示与模型组大鼠比较，总木脂素组大鼠血清中ALT，AST，ALP，TGF-β₁，HA和HYP水平显著降低（P<0.05，P<0.01），肝脏组织匀浆液中SOD浓度水平明显升高（P<0.05，P<0.01），肝脏病理损伤明显减轻（P<0.05，P<0.01），肝纤维化评分明显降低（P<0.05，P<0.01）。通过以上实验说明波棱瓜子总木脂素能有效减轻CCl4致大鼠肝纤维化的肝脏损伤，降低肝纤维化程度，其机制可能与其保肝降酶抑制TGF-β₁表达有关。

[关键词]总木脂素； 肝纤维化； TGF-β₁

[Abstract]This experiment was aimed to discuss the protective effect and mechanism of total lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum seeds on carbon tetrachloride （CCl4）-induced liver fibrosis in rats. Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the blank control group （G1）， model group （G2）， total lignans high， middle and low dose groups （400，200， and 100 mg·kg^-1·d^-1）（G3/4/5） and the glycyrrhizin positive control group （25 mg·kg^-1·d^-1）（G6）， N=8 in each group. The rats in blank group received normal feeding； the rats in model group， total lignans low， middle and high dose groups and glycyrrhizic group were subcutaneously in jected with 3 mL·kg^-1 olive oilsolution containing 40%CCl4every two or three days for Eight weeks. During the course， the rats inblank group and model group were orally administered with 2 mL normal saline， and the rats in total lignans groups and the glycyrrhizin positive control group received corresponding doses of drugs by intragastric administration. Eight weeks later， after the the last time modeling， the rats were sacrificed. Then the biochemical analysis was used to determine alanine aminotransferase（ALT）， aspartate aminotransferase（AST）， and alkaline phosphatase （ALP） levels in serum while enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） was applied for detecting transforming growth factor β₁（TGF-β₁）， hyaluronic acid（HA）， hydroxy-proline（HYP） and superoxide dismutase（SOD） levels in serum. HE and Masson's trichrome stainings were conducted in liver tissues to observe the pathological variations and grades of hepatic fibrosis. The results showed that as compared with the model group， the levels of ALT， AST， ALP， TGF-β₁， HA， HYP and SOD in serum of total lignans groups were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）； levels of SOD in the liver tissue homogenate were increased（P<0.05， P<0.01）； the pathological damage of the liver tissues were relieved （P<0.05， P<0.01）， and liver fibrosis scores were decreased（P<0.05， P<0.01）. The above experimentsindicated that total lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum seeds can effectively reduce carbon tetrachloride-induced hepatic injury of rat liver fibrosis， reduce the degree of liver fibrosis， and its mechanism maybe associated with down-regulating TGF-β₁ expression.

[Key words]total lignans； liver fibrosis； TGF-β₁

波棱瓜子是葫芦科波棱瓜的干燥成熟种子，常用于藏药方剂中，具有助消化、清热降火的作用，性寒、味苦，在民间主要用来医治消化不良，赤巴病，胆病，肝病（肝热、黄疸型传染性肝炎）等^[1]。前期研究过程中，发现波棱瓜子对治疗各类肝病有很好的疗效，如抗乙肝病毒，保肝降酶，对免疫性肝损伤有较好活性^[2]。并在前期试验中确定了其有效部位为总木脂素部位。然而其治疗和预防肝纤维化的研究还未见报道，作用机制尚不明确。故本课题拟建立CCl4致大鼠肝纤维化病理模型，探讨波棱瓜子总木脂素对肝纤维化的保护作用及其作用机制，为该药的临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 波棱瓜子总木脂素部位（经西南民族大学顾健教授提供，Abcam公司）；转化生长因子-β₁（TGF-β₁，货号XL-Er0400）、透明质酸（HA，货号XL-Er0451）、羟脯氨酸（HYP，货号XL-Er1602）、超氧化物歧化酶（SOD，货号XL-Er1377）ELISA试剂盒，北京永辉生物科技有限公司进口分装；HE染色试剂；Masson三色胶原试剂。

1.2 动物 SPF级雄性SD大鼠48只，合格证号SCXK（川）2013-24，适应环境1周后开始实验。

1.3 仪器 TFT185W80PS计算机（冠捷显示科技有限公司）；Multlskan Mk3酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；BA200 Digital数码三目摄像显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司）；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 大鼠称重后随机分为空白对照组、模型组、总木脂素低、中、高剂量（100，200，400 mg·kg^-1）组、阳性药甘利欣（25 mg·kg^-1）组，每组8只。除空白对照组外，其他各组大鼠由皮下注射40%CCl4的橄榄油溶液，首次注射5 mL·kg^-1，而后每隔2～3 d注射3 mL·kg^-1，连续造模9周^[3-4]。期间每天按时给予空白组、模型组灌胃等量生理盐水2 mL，总木脂素低、中、高剂量组、甘利欣组灌胃给药相应剂量2 mL。末次给药后禁食不禁水24 h，大鼠称体重，腹主动脉取血，离心取上层血清，-20 ℃保存待检，取新鲜肝脏，称重，切下一小部分10%福尔马林浸泡，另一部分制备肝匀浆，-80 ℃保存待检。

2.2 肝脏指数 处死大鼠前称体重，取出肝脏，滤纸拭干后立即称质量，计算肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量（g）/体重（g）×100。

2.3 肝功能 应用自动生化仪检测大鼠血清中肝功能指标丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的水平。

2.4 ELISA法检测大鼠血清中肝纤维化指标TGF-β₁，HA，HYP的水平 ELISA法检测大鼠肝匀浆SOD水平，按ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪检测大鼠血清中TGF-β₁，HA，HYP及肝匀浆SOD水平。

2.5 病理形态学观察 取处理过的大鼠肝组织，HE染色，光镜下观察（×100/400）肝组织病理学改变。

2.6 Masson三色胶原染色 取处理过的大鼠肝组织，Masson染色，先于100倍光镜下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取100倍和400倍采集图像。对各组大鼠肝纤维化程度进行评分，得分越高，表示纤维化程度越重。

2.7 统计学分析应用 SPSS 17.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），数据以±s表示。

3 结果

3.1 模型成功判定标准及大鼠死亡情况 造模第9周末，各组随机处死大鼠2只。模型组大鼠体重较轻，肝脏色泽暗黄、表面粗糙、体积未见明显改变、边缘较钝、质地较实、有结节感；血清ALT，AST，ALP水平均明显升高；病理组织学观察可见肝纤维化，Masson三色胶原染色可见明显的纤维结缔组织，证实肝纤维化造模成功。随即处死所有大鼠。实验期间大鼠死亡2只，第4周，第5周模型组和總木脂素低剂量组在造模后的第2天各死亡1只。

3.2 对大鼠一般状态和肝脏系数的影响 对照组大鼠发育良好，无死亡。模型组大鼠精神萎靡、毛色无光泽、活动较少、厌食、发育缓慢、体重减轻。总木脂素中、高剂量组大鼠体重增加，每次造模的第3天活动较为正常，另甘利欣组大鼠体重明显低于总木脂素组，并出现了脱毛现象。与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数显著增加（P<0.001），与模型组比较，总木脂素各组大鼠肝脏指数显著降低（P<0.05），见表1。

3.3 对肝纤维化大鼠肝功能指标的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT，AST，ALP水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，总木脂素低、中、高、甘利欣各剂量组大鼠血清中ALT，AST，ALP水平显著降低（P<0.05，P<0.01），其中总木脂素中、高剂量组与甘利欣组组间无显著差异，见表2。

3.4 对肝纤维化大鼠血清中肝纤维化指标的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清中TGF-β1，HA，HYP的水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，总木脂素低、中、高、甘利欣各剂量组上述指标显著下降（P<0.05，P<0.01）。其中总木脂素中、高剂量组与甘利欣组组间无显著差异，见表3。

3.5 对纤维化大鼠肝匀浆SOD水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠肝匀浆SOD水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较，总木脂素低、中、高、甘利欣各剂量组上述指标显著上升（P<0.05，P<0.01）。其中总木脂素中、高剂量组与甘利欣组组间无显著差异，见表4。

3.6 各组大鼠肝组织病理学观察 HE染色可见，对照组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，肝细胞无变性坏死和淋巴细胞浸润，未见纤维沉积。模型组大鼠汇管区纤维结缔组织大量增生，肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，肝细胞坏死明显，有大量淋巴细胞浸润，部分可见假小叶形成。总木脂素中、高剂量组大鼠肝脏汇管区有少量纤维组织增生，肝细胞变性坏死明显减轻，少量淋巴细胞浸润，未见假小叶形成；总木脂素低剂量组大鼠汇管区纤维结缔组织增生较明显，个别小叶结构被破坏，少部分出现假小叶，肝损伤程度介于模型组和总木脂素中、高剂量组之间。高剂量肝损伤程度较轻于甘利欣组，见图1。

Masson三色胶原染色显示，对照组大鼠肝脏汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成。模型组大鼠肝脏汇管区大量胶原纤维增生，增生的胶原纤维形成纤维分隔，并破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶，假小叶形成明显。总木脂素中、高剂量组大鼠肝脏胶原纤维明显减少，只见汇管区有一定的纤维组织增生，少部分亦见胶原向周边延伸，无假小叶存在；其低剂量组大鼠肝组织纤维结缔组织增生较明显，个别小叶结构被破坏，未出现假小叶，肝损伤程度介于模型组和总木脂素中、高剂量组之间。纤维化程度评分见表5；结果见图2。

4 讨论

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，是各种慢性肝病共有的病理过程。肝纤维化的发生以细胞外基质（ex-tracellular matrix，ECM）的合成与降解的失衡后，ECM过度沉积为病理特征。ECM主要来源于肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSC），并由涉及HSC的激活与分化调控机制最终形成ECM过度沉积，导致肝纤维化的发生^[6-8]。

本实验通过组织病理学和血液生化实验发现，波棱瓜子总木脂素对CCl4致肝纤维化大鼠肝脏在具有明显的组织形态保护作用的同时，能够明显降低肝纤维化大鼠血清中AST，ALT和ALP的水平。结果说明，波棱瓜子总木脂素对CCl4致肝纤维化大鼠的肝组织及肝功能损伤具有明显的保护作用。

HA是一种糖胺多糖，是细胞体基质的主要组成成分，主要由肝内皮细胞摄取分解。肝细胞持续受损时，HA合成增加。而肝窦内皮细胞受损，数量减少的同时使分解HA的能力减弱，导致释放入血清中的HA含量增加。血清HA升高能反映活动性肝纤维化程度，是反映肝纤维化最具价值的临床诊断血清学标志物^[9-11]。人体HYP占胶原蛋白比例最大，胶原蛋白是组织中胶原纤维的主要成分，胶原纤维广泛分布于人体各个组织。因此，胶原蛋白占人体蛋白质很大比例。根据HYP在胶原蛋白中含量最高这一属性，通过对肝组织中HYP的测定，可以了解肝脏中胶原蛋白的代谢情况，也可间接反映肝纤维化的程度和发展过程^[10-11]。通过本试验发现波棱瓜子总木脂素可以明显降低造模后HA，HYP含量。结果表明，波棱瓜子总木脂素是通过降低血清中HA，HYP含量来达到对CCl4致肝纤维化大鼠的肝组织及肝功能的保护作用。

TGF-β₁是重要的肝纤维化调节因子。当肝组织受到各种损伤因素攻击时，HSC受Kupffer氏细胞分泌的TGF-β₁激活分泌大量ECM的同时，又进一步分泌大量的TGF-β₁，激活周围静止更多的HSC。这种正反馈作用是TGF-β₁加强HSC合成基质胶原进而致肝纤维化持续发展的原因之一^[12-14]。实验结果得出，波棱瓜子总木脂素能够减少肝纤维化大鼠肝脏胶原蛋白合成的同时，下调肝组织中TGF-β₁的蛋白的表达。说明波棱瓜子总木脂素对CCl4致肝纤维化大鼠的肝组织及肝功能损伤的保护作用可能与下调TGF-β₁的蛋白的表达，减少基质胶原的合成、沉积有关。也间接表明，波棱瓜子总木脂素很有可能会参与到诱导肝星状细胞的凋亡之中。而其参与肝纤维化的细胞内信号通路的影响，则有待于进一步的研究。此外在实验中发现，其下调TGF-β₁的蛋白的表达能力要强于阳性药甘利欣。

目前，就肝纤维化形成机制的研究已初步完成，尚有很多影响纤维化形成的原因尚不明确。在本实验中，已初步证明波棱瓜子总木脂素对CCl4致肝纤维化大鼠的肝组织及肝功能损伤具有明显的保护作用。在后续工作中，会继续研究其对肝星状细胞的凋亡影响，以及在治疗肝纤维化的药效和机制上做进一步的深入研究，为临床用药提供强有力的证据。

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[责任编辑 张宁宁]