茵陈提取物中化学成分的UHPLC—LTQ—Orbitrap快速鉴定
2017-03-20欧阳文竹尚展鹏王文建王守旭沈家序
欧阳文竹+尚展鹏+王文建+王守旭+沈家序+钱浩+马志国+张加余
[摘要]应用UHPLC-HR-MSn技术分析检测茵陈提取物中的化学成分。采用ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱和0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）流动相系统进行梯度洗脱；应用LTQ-Orbitrap质谱负离子模式检测茵陈提取物中的化学成分。根据精确分子量数据和多级质谱碎片离子，结合对照品比对和文献报道，共从茵陈提取物中分析鉴定了50个化学成分，包括21个黄酮、22个有机酸、6个香豆素和1个其他类成分。应用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液质联用技术较为全面地阐明了茵陈提取物中的化学成分，为进一步研究茵陈提取物的全面质量控制方法、体内代谢过程以及药效物质基础提供了科学依据。
[关键词]茵陈提取物； 液质联用技术； 化学成分鉴定
[Abstract]A rapid and sensitive UHPLC-HR-MSN method was developed for the identification of chemical constituents in capillary wormwood extract. ACQUITY UHPLC HSS T3 chromatography column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was used with 0.1% formic acid-acetonitrile solution as the mobile phase in gradient elution. The extract was detected by ESI-LTQ-Orbitrap equipped with an ESI ion source in a negative mode. Based on the accurate mass measurements， retention time， mass fragmentation patterns and literature reports， a total of 50 compounds including 21 flavonoids， 22 phenolic acids， 6 coumarins and 1 other compound were tentatively screened and characterized. These results are helpful for the comprehensive quality control， better comprehension of the metabolism and further study of pharmacodynamic substance from capillary wormwood extract.
[Key words]capillary wormwood extract； UHPLC-LTQ-Orbitrap MS； chemical constituent identification
茵陳为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿A. capillaries Thunb.的干燥地上部分。我国大部分地区均有分布，主产于安徽、浙江、江苏、陕西等省。春季和秋季采收茵陈的分别习称“绵茵陈”和“花茵陈”[1]。茵陈味苦、辛，性微寒，归脾、胃、肝胆经，具有清热利湿、利胆退黄之功效，是一种具有保肝功效的特色中药，常与其他中药配伍用于治疗甲、乙型和黄疸型肝炎。现代研究表明，茵陈中的主要化学成分包括黄酮、有机酸、香豆素、色原酮以及挥发油等。茵陈提取物则是绵茵陈经提取制成的，其质量标准被收载于《中国药典》2015年版一部[2]。目前，现行标准中仅对绿原酸等成分进行质量控制，其他成分尚不明确。这无疑不利于茵陈提取物的全面质量控制和药效物质基础研究。因此，亟需建立一种快速、简便的分析方法来全面阐明茵陈提取物中的化学成分。
LC-MS技术具有灵敏度高、选择性强且碎片离子重现性好等诸多优点，已广泛用于中药化学成分的结构鉴定[3-5]。其中，线性离子阱与Orbitrap傅里叶扫描质谱组成的串联质谱仪（LTQ-Orbitrap hybrid mass spectrometry）将线性离子阱的多级质谱功能和Orbitrap高分辨能力质谱结合起来，可同时实现多级质谱碎裂和母离子的高分辨数据采集，为小分子药物及大分子蛋白质的鉴定提供更准确信息[6-8]。本文基于UHPLC-LTQ-Orbitrap建立茵陈提取物中化学成分的分析方法，并结合精确分子质量数据、碎片离子和对照品比对等手段进行结构鉴定，以期为阐明其物质基础进而建立全面的质量控制方法提供科学依据。
1 材料
Ultimate 3000超高效液相色谱仪与LTQ-Orbitrap XL 质谱，配有电喷雾离子源（ESI），Xcalibur 2.1 工作站（美国Thermo Scientific公司）；Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore 公司）；KQ-250DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；R200D 型电子分析天平（1/10万，德国Sartorius 公司）。
菌除法药材产地为广东梅州，经暨南大学药学院张英副教授鉴定为菊科植物茵陈蒿A.capillaris的干燥地上部分。
5-咖啡酰奎宁酸（批号110753-200413）购自中国食品药品检定研究院；3-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸等对照品购自成都曼思特生物科技有限公司。所有对照品纯度均大于98%。乙腈和甲醇（质谱级，德国Merck公司），甲酸（色谱级，德国Merck公司），其他均为分析纯。
2 方法
2.1 茵陈提取物的制备
取绵茵陈，用90%乙醇作为溶剂，浸渍24 h后进行渗漉，收集渗漉液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15 （60～65 ℃）的清膏，加6倍量水，冷藏，静置，滤过，滤液120 ℃加热1 h，冷藏，静置，加入0.2%活性炭，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.20 （60～65 ℃）的清膏，80 ℃真空干燥，即得。
2.2 混合对照品溶液的制备
分别取上述6种对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度约为100 mg·L-1的储备液；分别精密吸取各储备液适量，加甲醇定容于5 mL量瓶中，即得。
2.3 供试品溶液的制备
称取茵陈提取物0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，混匀，静置，取上清液，以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 色谱条件
色谱柱ACQUITY UHPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱0～4 min，3%～19% B，4～10 min，19%～20% B，10～13 min，20%～21% B，13～17 min，21%～40% B，17～20 min，40%～90% B；柱温35 ℃，流速为0.40 mL·min-1；检测波长327 nm；进样量5 μL。
2.5 质谱条件
负离子检测模式，毛细管温度350 ℃，鞘气流速30 arp，辅助气流速10 arp，喷雾电压3 kV，毛细管电压-35 V，管透镜电压-110 V。样品采用FT进行FS扫描和PIL扫描，分辨率为3万，扫描范围m/z 100～800，隔离宽度2；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选取上一级丰度最高的2个峰进行碰撞诱导解离碎片离子扫描，激活单位0.25 q，激活时间30 ms，归一化碰撞能量为35%。
3 结果
应用 HPLC-DAD-LTQ-Orbitrap MSN法，结合多级质谱碎片离子信息、对照品比对以及相关文献报道，对茵陈提取物中的4大类50个化合物进行了分析鉴定，其中包括黄酮21个、有机酸22个、香豆素6个以及其他类1个。混合对照品和茵陈提取物的 HPLC-DAD 色图谱与总离子流图（TIC）见图1，各类成分的归属信息见表1。
3.1 黄酮类化合物的鉴定
本实验从茵陈提取物中筛选鉴定了21个黄酮类化合物，其中包括黄酮醇11个，黄酮4个，二氢黄酮3个，二氢黄酮醇、查尔酮以及黄烷酮各1個。
3.1.1 黄酮醇类化合物 主要包括9个黄酮醇糖苷和2个黄酮苷元。化合物48和45的准分子离子峰分别为m/z 301.033 7 [M-H]-和m/z 299.054 9 [M-H]-，由此推断它们的分子式为C15H10O7 （误差-1.99）和C16H12O6 （误差-0.33）。在化合物48的ESI-MSN谱中，m/z 301首先丢失1分子H2O产生m/z 283，再失去1分子CO产生m/z 255，同时还产生RDA碎片离子1，3A-m/z 151。经相关文献对比后将其鉴定为槲皮素[9-10]。而化合物45的m/z 299[M-H]-在多级质谱裂解中产生RDA碎片离子m/z 193 （C9H5O5-）。结合文献中的茵陈化学成分相关报道，将其鉴定为鼠李柠檬素[11-12]。
化合物22，30和31的准分子离子峰均为m/z 463.08 [M-H]-，且在ESI-MS2谱均出现m/z 301，说明它们可能是以槲皮素或异槲皮素为苷元的黄酮醇糖苷。而中性丢失的糖基团相对分子质量为162表明三者可能是葡糖糖苷或半乳糖苷。同时，三者均产生m/z 179 和m/z 151 的特征RDA碎片离子。结合在茵陈中已报道的化学成分，将它们依次推断为槲皮素-7-O-葡萄糖苷、金丝桃苷和槲皮苷[13]。
化合物32和39的准分子离子峰均为m/z 447.09 [M-H]-，说明二者为同分异构体。然而，二者的多级质谱图存在较大差异，说明它们的母核并不相同。化合物32产生苷元碎片离子m/z 301，
4.3-咖啡酰奎宁酸；7.5-咖啡酰奎宁酸；9.4-咖啡酰奎宁酸；16.1，3-二咖啡酰奎宁酸；34.1，5-二咖啡酰奎宁酸；43.4，5-二咖啡酰奎宁酸；A. 6个对照品溶液UHPLC图谱；B. 茵陈提取物UHPLC图谱； C. 6个对照品溶液TIC图； D.茵陈提取物TIC图。
可将其鉴定为槲皮素-3-O-鼠李糖苷[13]。化合物39的[M-H]-离子m/z 447.09则中性丢失相对分子质量为162后生成m/z 285，并进一步中性丢失1分子CO产生m/z 257，由此将其鉴定为山柰酚-3-O-葡萄糖苷[14]。
化合物36的准分子离子峰为m/z 623.160 0，由此推断其分子式为C28H32O16，误差为1.1。其二级离子碎片离子m/z 315表明其苷元可能为异鼠李素，而中性丢失的碎片离子质量数m/z 308则表明为其可能是刺槐糖苷。在进一步的质谱裂解过程中，m/z 315丢失1分子CH3·后产生m/z 300，然后继续失1分子HCO·和CO分别产生m/z 271和m/z 243，进一步验证了上述推断。由此，将化合物36鉴定为异鼠李亭-3-O-刺槐苷。经分析，化合物33和42与化合物36具有相同的母核，只是糖取代种类不同。结合文献报道，将化合物33和42分别鉴定为异鼠李素-3-O-半乳糖苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷[9，15]。
化合物17的准分子离子峰为m/z 609.142 9 [M-H]-，由此推断其分子式为C27H29O16 （误差-3.45）。在多级质谱裂解过程中，m/z 609 中性丢失其糖基团后得到碎片离子m/z 301（典型的黄酮醇苷元）。而m/z 301在ESI-MS3谱中则产生m/z 179 和m/z 151，这与槲皮素的裂解方式基本一致。因此将其鉴定为芦丁。
3.1.2 黄酮类化合物 主要包括9个黄酮醇糖苷和2个黄酮苷元。化合物23的准分子离子峰为461.071 4 [M-H]-，可推断其分子式为C27H29O16 （误差-0.22）。在其ESI-MS2谱中，苷元离子m/z 285表明其可能为木犀草素的葡萄糖苷；而其他碎片离子m/z 443 [M-H-H2O]-和m/z 415 [M-H-H2O-CO]-，进一步表明该化合物为木犀草素-7-O-葡糖糖苷[16]。
化合物40的准分子离子峰为269.043 8 [M-H]-，最有可能的分子式为C15H9O5 （误差-2.23）。结合文献报道以及分子式推测其可能是芹菜素[17]。而m/z 269通过中性丢失H2O+CO后产生m/z 223以及RDA 碎片离子m/z 121（C7H3O4-）则进一步验证了上述推断。
化合物5的准分子离子峰为m/z 313.070 5 [M-H]-，可知其分子式为C17H14O16 （误差-0.22）。在进一步的质谱裂解过程中，m/z 313分别产生m/z 298 [M-H-CH3·]-，283 [M-H-2CH3·]-，255 [M-H-2CH3·-CO]-。结合文献报道，将其鉴定为蓟黄素[18]。同理，可将化合物49鉴定为芫花素[1]。
3.1.3 其他黄酮类化合物 主要包括二氢黄酮3个（化合物25，35，41）、二氢黄酮醇（化合物38）、查尔酮（化合物14）以及黄烷酮（化合物50）各1个。化合物35和41的准分子离子峰均为m/z 271.06[M-H]-（C15H11O5，误差<2）。在ESI-MS2谱中，二者均产生二氢黄酮类化合物典型的RDA碎片离子m/z 151（C7H3O4-），由此可将两者分别鉴定为柚皮素或其同分异构体。化合物25的准分子离子峰为m/z 285.074 9 [M-H]-，可知其分子式为C16H13O5 （误差-3.16）。在进一步的质谱裂解过程中，其主要通过发生RDA裂解产生m/z 165和m/z 121等碎片离子。根据相关文献[9]，将其鉴定为8-去甲基杜鹃素。
化合物38的准分子离子峰为m/z 301.070 9 [M-H]-，可知其分子式为C16H13O6 （误差0.66）。其主要ESI-MSN碎片离子m/z 165 （C8H5O4-）是m/z 301丢失B环部分后产生的，同时还继续脱去1分子CO2产生m/z 135。结合相关文献报道[9]，将其鉴定为7-甲基香橙素。
化合物14的准分子离子峰为m/z 593.149 4 [M-H]-，可知其分子式为C27H29O15 （误差-1.18）。在随后的多级质谱裂解过程中，其进一步产生m/z 575 [M-H-H2O]-，473 [M-H-H2O-C8H8O]-，353 [M-H-H2O-2C8H8O]-，由此將化合物14鉴定为红花黄色素A。
化合物50具有典型的黄酮类化合物的碎片离子峰如m/z 255，179，151等。结合相关文献报道[19]，可将其鉴定为 （-）-表阿夫儿茶精。
3.2 有机酸类化合物的鉴定
本实验从茵陈提取物中鉴定了22个有机酸，其中21个为绿原酸类化合物，1个为原儿茶酸。按照奎宁酸上的咖啡酰、对香豆酰以及阿魏酰等取代基的数目，可将绿原酸类化合物分为单取代（11个）、双取代（8个）以及三取代（2个）等 [20-21]。
3.2.1 单取代奎宁酸类化合物 主要包括咖啡酰奎宁酸4个、对香豆酰奎宁酸及其苷类化合物5个，阿魏酰奎宁酸2个。化合物3，4，7，9均产生准分子离子峰m/z 353.09，可知其分子式为C16H17O9 （误差< 5）。通过与对照品比对，将化合物4，7，9分别准确鉴定为新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸。同时，化合物3同样产生m/z 191 [quinic acid-H]-和m/z 179 [caffeic acid-H]-等主要碎片离子，结合文献报道中绿原酸同分异构体在反相色谱柱上的保留行为差异，将其鉴定为1-咖啡酰奎宁酸[22]。
化合物的6和15的准分子离子峰为m/z 337.09，可推断其分子式为C16H17O8，误差均小于3。在ESI-MS2谱中，m/z 337分别产生各自的基峰离子m/z 163和m/z 173，由此可将二者分别鉴定为3-对香豆酰奎尼酸和4-对香豆酰奎尼酸[23]。化合物10，13，20则产生准分子离子峰m/z 449.14，可推断分子式为C22H27O13，误差均小于5。在ESI-MS2谱中，m/z 449均可通过中性丢失1分子葡萄糖残基（162）产生m/z 337，说明它们可能是对香豆酰奎宁酸葡萄糖苷。同时，在ESI-MS2谱中，其他主要碎片离子m/z 191，173，163的产生表明它们的苷元可能是5-对香豆酰奎宁酸、4-对香豆酰奎宁酸和3-对香豆酰奎宁酸。由于苷元上的羟基取代位点较多，单纯应用LC-MS方法难以确定葡萄糖在苷元上的取代位置。因此，仅将它们鉴定为5-对香豆酰奎宁酸葡萄糖苷、4-对香豆酰奎宁酸葡萄糖苷和3-对香豆酰奎宁酸葡萄糖苷。
化合物18和19均产生准分子离子峰m/z 367.10。根据所获得的高分辨质谱精确分子质量以及多级质谱碎片离子信息，推断最可能的分子式为C17H19O9，误差均小于2，表明它们可能是阿魏酰奎宁酸类化合物。在负离子检测模式下，化合物18和19的ESI-MS2谱图存在差异：m/z 367分别产生m/z 191和m/z 173的基峰离子。参考文献[23]，将化合物18和19分别鉴定为5-阿魏酰奎宁酸和4-阿魏酰奎宁酸。
3.2.2 双取代奎宁酸类化合物 化合物16，34，37，43均产生准分子离子峰m/z 515.11 [M-H]-。根据所获得的高分辨质谱精确分子质量可推断其分子式为C25H23O12，误差小于5。在多级质谱裂解过程中，m/z 515均产生特征碎片离子m/z 353 [M-H-C6H10O6]-，由此推断这4个化合物为双咖啡酰奎宁酸。通过与对照品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰以及多级质谱裂解碎片离子信息相比对，可将化合物34，37，43准确鉴定为1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸[24]。化合物16的m/z 515依次中性丢失咖啡酰基团，产生m/z 353和m/z 191。同时，m/z 353进一步裂解产生ESI-MS3谱基峰离子m/z 191，且m/z 179的相对丰度也接近50%，由此确定其分子中有1个3-咖啡酰基取代。结合其他碎片离子，如m/z 173 [M-H-2Caffeoyl-H2O]-等，可将其鉴定为1，3-二咖啡酰奎宁酸[25]。
化合物21，27，29均产生准分子离子峰m/z 529.13 [M-H]-。根据所获得的高分辨质谱精确分子质量可推断其分子式为C26H25O12，误差小于5。在进一步的质谱裂解过程中，m/z 529可以通过丢失1分子咖啡酰基或阿魏酰基分别产生m/z 367 或m/z 353，说明它们是阿魏酰咖啡酰奎宁酸类化合物（混合型）。由于在质谱数据采集过程中未获得足够的碎片离子信息，尚难以确定咖啡酰基或阿魏酰基在奎宁酸母核上的取代位置。因此，仅将这3个化合物分别鉴定为咖啡酰阿魏酰奎宁酸-1、咖啡酰阿魏酰奎宁酸-2和咖啡酰阿魏酰奎宁酸-3。
化合物44产生准分子离子峰m/z 475.088 0 [M-H]-，由此推断其分子式为C22H19O11（误差 1.89）。m/z 475在进一步的裂解过程中，通过中性丢失1分子咖啡酰基产生m/z 313（对应香豆酰奎尼酸），由此可以将其鉴定为香豆酰咖啡酰奎宁酸。其另一重要碎片离子m/z 191的产生也进一步印证了上述推断。但是，由于缺乏相应的对照品，香豆酰和咖啡酰在奎宁酸母核上的具体取代基位置尚难以确定，由此将仅化合物44鉴定为香豆酰咖啡酰奎宁酸。
三取代奎宁酸类化合物：化合物46和47在负离子模式下均产生准分子离子峰m/z 677.15 [M-H]-，由此推断其分子式为C34H29O15 （误差<3）。在它们的ESI-MS/MS裂解过程中，m/z 677依次丢失1分子咖啡酰基后产生m/z 515和m/z 353，同时产生了m/z 191和m/z 173等特征碎片离子，由此推断它们为三咖啡酰奎宁酸类化合物。由于缺乏相应的对照品，咖啡酰基在奎宁酸母核上的取代位置尚难以确定，因此仅将化合物46和47鉴定为三咖啡酰基奎宁酸-1和三咖啡酰基奎宁酸-2。
其他有机酸类化合物：化合物2产生准分子離子峰m/z 315.070 6 [M-H]-，由此推断其分子式为C13H15O9（误差-1.59）。在进一步的质谱裂解过程中，m/z 315可通过中性丢失1分子葡萄糖产生m/z 153，并可继续丢失1分子CO2产生m/z 109。结合文献报道[23]，可将其鉴定为原儿茶酸-3-O-葡萄糖苷。
3.3 香豆素类化合物的鉴定
本实验从茵陈提取物中鉴定了6个香豆素类化合物。通过查阅文献得知，茵陈中香豆素类化合物母核上的取代基主要有-OH和-OCH3。结合高分辨质谱数据中准分子离子峰[M-H]-的精确质量数和文献报道[26]，初步确定化合物8，11，12，24，26，28为香豆素类化学成分。在ESI-MS/MS裂解过程中，[M-H]-离子的特征裂解方式为中性丢失CO，CH3·和H2O等，并产生相应的碎片离子。由此，对上述6个香豆素类化合物的结构进行了推断，结果见表1。
3.4 其他化合物的鉴定
本实验从茵陈提取物中鉴定了1个其他类化合物。化合物1在负离子模式下产生准分子离子峰m/z 341.107 1 [M-H]-，由此推断其分子式为C12H21O11（误差-2.05）。在进一步的质谱裂解过程中，m/z 341通过丢失1分子葡萄糖残基产生m/z 179 [M-H-Glu]-，同时产生m/z 161 [179-H2O]-和m/z 143[179-2H2O]-等。因此，可将化合物1鉴定为龙胆二糖。
4 讨论
本文采用的UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液质联用技术在中药复杂体系物质基础研究中具有显著优势：UHPLC采用亚2 μm颗粒度的色谱柱填料，不仅能获得更高的柱效，还可在更宽的线速度范围内保持恒定的柱效，以获取更好的分离效率、峰容量和灵敏度；LTQ-Orbitrap高分辨液质联用仪可同时进行多个数据关联的MS/MS的扫描，能为小分子药物的鉴定与分析提供了更准确的信息。
本文采用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液质联用技术对茵陈提取物中的化学成分进行分析检测，结果共筛选鉴定了50个化合物，包括21个黄酮、22个有机酸、6个香豆素以及1个其他类成分。本研究可为下一步的茵陈提取物质量控制、药理、药效研究等提供前提与基础，并为进一步的体内代谢过程以及药效物质基础研究提供科学依据。
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[责任编辑 丁广治]
