黄连属部分药用植物遗传多样性与亲缘关系的SCoT分析

陈大霞+王钰+张雪+潘媛+李隆云

[摘要]采用SCoT分子标记分析4种黄连属药用植物的遗传多样性和亲缘关系，并用POPGENE计算遗传参数，TREECONW软件进行聚类分析。结果表明：28条引物共检测到434条带，其中多态性条带430条；各遗传参数均表明黄连属药用植物种间的遗传多样性极为丰富（种间PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8），但种内遗传多样性较低（种内PPB=16.8%，N_a=1.168 2，N_e=1.073 0，H=0.043 7，I=0.067 7）；遺传分化系数G_st=0.794 0，说明79.4%的遗传变异来源于种间；同种黄连属药用植物的不同植株均聚在一起，证实SCoT分子标记可作为黄连属药用植物亲缘关系研究的有效方法之一。

[关键词]黄连属； SCoT； 药用植物； 亲缘关系

[Abstract]The genetic diversity and genetic relationship among four medicinal species of Coptis were detected by the approach of sequence-related amplified polymorphism （SCoT）. The associated genetic parameters were calculated by POPGENE1.31. The systematic diagram of genetic relationship were clustered by TREECONW. The results showed that a total of 434 bands were produced by using 28 primers， of which 430 were polymorphic loci. There was a high level of genetic diversity among species （PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8）. However， genetic diversity was lower within species， the average of genetic parameters wasPPB=16.8%，N_a=1.168 2， N_e=1.073 0，H=0.043 7，I=0.067 7. The Nei′s genetic differentiation coefficient was 0.794 0， that indicated that most of the genetic variation existed among species. By clustering analysis， different individuals gathered in the same group. The results confirmed that SCoT marker can be used as one of the effective methods to reveal the genetic diversity and relationship among medicinal species of Coptis.

[Key words]SCoT； Coptis； medicinal plant； genetic relationship

黄连为名贵常用中药之一，始载于《神农本草经》，在我国已有2 000多年的药用历史，具有清热燥湿，泻火解毒的功效。我国分布的黄连属植物中黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连C. deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.及云南黄连C. teetoides C.Y.Cheng.是《中国药典》各版本收录药材黄连的基原植物 [2]。此外，分布于四川峨眉、雅安与洪雅地区的峨嵋野连C. omeiemsis （Chen） C.Y.Cheng.、西藏南部昌都地区的西藏黄连C. teeta Wall.及四川马边一带的线萼黄连C. linearisepala T.Z.Wang et C.K.hsieh.等多种栽培或野生黄连属植物的根茎作为药用。《日本药局方》除收载了《中国药典》收录药材黄连的基原植物外，还收载了日本黄连C.japonica Makino.。因此，理清黄连属法定用种及地方用种的亲缘关系，准确进行基原鉴别对确保黄连的临床用药安全具有重要意义。

黄连属药用植物亲缘关系的研究及鉴别早期主要侧重于外部形态特征^[1]、数量分类^[2]及核型研究^[3-4]。近年来，将分子标记技术应用于黄连属药用植物遗传多样性与亲缘关系的研究报道逐渐增多。本文以黄连属的4种药用植物为研究对象，采用SCoT（sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性标记）分子标记技术^[5]研究黄连属药用植物种间的遗传特征，探讨物种间的亲缘关系，为黄连属药用植物的鉴定建立新方法，为形态分类提供分子水平的依据。

1 材料和方法

1.1 供试黄连 供试的黄连属4种药用植物见表1，其中黄连为长期人工栽培种，峨眉黄连与三角叶黄连为就地保护抚育与栽培，日本黄连为引进栽培。采集植株的幼嫩叶片洗净晾干后，放入装有足量硅胶的自封袋快速干燥。回到实验室后，取出叶片提取基因组DNA。每种药用植物均采集24株。

1.2 仪器与试剂 PCR仪（S1000 Thermal Cycler，美国BIO-RAD）、凝胶成像系统（Gel Doc XR，美国BIO-RAD）、超微量分光光度计（ND-2000，美国Thermo Scientific）、电泳仪（DYY-6C型，北京六一）、电泳槽（DYCP-31F，北京六一）。

SCoT引物（上海生工）、植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根）、Trans2K Plus DNA Marker （北京全式金）、TaqDNA聚合酶（日本TOYOBO）、dNTPs（日本TOYOBO）、GelRed核酸凝胶染料（美国Biotium）、琼脂糖（进口分装），其余试剂为国产分析纯。

1.3 基因組DNA的提取 采用植物基因组DNA提取试剂盒提取4种黄连属药用植物，共计96个植株的基因组DNA，浓度和纯度采用超微量分光光度计进行测定。扩增时，将DNA浓度稀释至40 mg·L^-1。

1.4 PCR扩增与电泳检测 从Collard和Mackill^[5]开发的SCoT引物中筛选出28条扩增条带清晰的引物用于SCoT-PCR扩增，引物序列见表2。SCoT-PCR扩增反应总体积为15 μL，内含1×PCRbuffer，200 μmol·L^-1 dNTP，1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺，0.4 μmol·L^-1引物，1 U TaqDNA聚合酶和40 ng模板，不足部分用灭菌的超纯水补足。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36 个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。取5 μL PCR扩增产物与2.5 μL 6×DNA 上样缓冲液（内含GelRed核酸凝胶染料）混匀后，以1×TAE为电泳缓冲液在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150 V。当溴酚蓝指示剂距凝胶前沿大约2～3 cm时停止电泳，取出凝胶在成像系统上观察、照相与保存。

1.5 数据的统计与分析 根据扩增条带的电泳迁移率及其有无统计数据，有带记“1”，无带记“0”。聚类分析采用TREECONW软件进行，遗传参数采用POPGENE version软件计算，包括多态位点百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）、表观等位基因数量（observed number of alleles， N_a）、等位基因有效值（Effective number of alleles，N_e）、Nei′s基因多样度指数（Nei′s gene diversity，H）、Shannon′s多样性信息指数（I）、总的基因多样度（Whole genetic diversity，H_t）、种内基因多样度（genetiv diversity within population，H_s）、种间基因多样性（genetic diversity among populations，D_st）、基因分化系数（genetic differentiation，G_st）、基因流（gene flow，N_m）。

2 结果与分析

2.1 SCoT标记的扩增多态性 筛选出28条扩增谱带清晰并呈现多态性的引物用于黄连属4种药用植物的亲缘关系分析， SP21的扩增图谱见图1。28条SCoT引物共扩增出434条带，其中有430条为多态性条带，占总扩增条带的99.1%。每个引物扩增条带数在7～22条，平均15.5条，其中多态性条带数7～22条，平均15.4条。从以上SCoT标记的扩增多态性数据可看出供试的4种黄连属药用植物遗传多样性极为丰富。

2.2 种间与种内的SCoT遗传多样性 POPGENE计算的各种遗传参数表明黄连属4种药用植物种间的遗传多样性非常丰富，见表3。种间的PPB=99.1%，N_a=1.990 6，N_e=1.329 3，H=0.212 2，I=0.337 8。但种内的遗传多样性极低，且变化幅度不大：PPB在10.4%～24.9%，平均为16.8%；N_a变化幅度在1.103 5～1.249 4，平均为1.168 2；N_e变化幅度在1.041 3～1.093 4，平均为1.073 0；H变化幅度在0.026 0～0.057 4，平均为0.043 7；I变化幅度在0.042 1～0.090 5，平均为0.067 7）。

2.3 种群遗传结构分析 在假设遗传平衡条件下计算出供试材料总基因多样性H_t=0.212 2，其中种内基因多样性H_s=0.043 7，种间的基因多样度性（D_st=H_t-H_s）为0.168 5，大于H_s；Nei′s的基因分化系数G_st=0.794 0，表明有79.4%的遗传变异存在于种间，20.6%的遗传变异存在于种内；基因流[N_m=0.5（1-G_st）/G_st]为0.129 7，表明种间基因交流处于极低等水平，交流极少。以上POPGENE计算出的遗传参数表明：供试黄连属药用植物种间的遗传多样性远大于种内的遗传多样性，种间存在着高度的遗传分化。

2.4 亲缘关系与聚类分析 POPGENE计算出供试黄连属药用植物种间遗传一致度在0.730 8～0.792 9，平均为0.765 0，遗传距离分布在0.232 1～0.313 6，平均为0.268 4，见表4。黄连、三角叶黄连与峨眉黄连3种黄连属药用植物之间的遗传一致度、遗传距离差异不大，表明三者之间的亲缘关缘较近。日本黄连与其他3种黄连属药用植物的遗传一致度较低，遗传距离较远，表明亲缘关系较远。

用TREECONW软件计算供试材料个体间的遗传距离，按UPGMA法进行聚类分析，建立聚类分支树状图，见图2。从聚类图中可看出：峨眉黄连与三角叶黄连首先聚为一支，再与黄连聚在一起；日本黄连处于单独一个进化枝上，与其他分子界限明显。个体聚类的置信值均为100，可信度极高，均聚在同种药用植物内。

3 讨论

3.1 基于分子标记的黄连属药用植物遗传多样性 从已有文献报道看，揭示黄连属药用植物遗传多样性主要采用RAPD标记，DNA条形码多用于探索黄连属药用植物的鉴别。常艳波^[6]采用RAPD标记揭示黄连属药用植物（黄连、三角叶黄连、云南黄连、峨眉黄连、线萼黄連、西藏黄连、日本黄连）在物种水平上多态位点比率（PPB）为97.46%，同一种C. chinesis居群间的多态位点比率为10.24%，显著低于物种间的多态位点比率，表明黄连属植物的遗传多样性是丰富的。武敬亮^[7]用RAPD标记揭示黄连属药用价值较大的4个物种（黄连、三角叶黄连、云连、峨眉黄连）之间多态性比例65.3%，说明各物种具有较为丰富的遗传多样性。韩凡^[8]用RAPD标记揭示4种黄连属药用植物（黄连、三角叶黄连、峨眉黄连和线萼黄连）的多态百分率为89.37%，说明黄连属样本之间遗传多样性较为丰富。本文的研究结果表明供试的4种黄连属药用植物物种水平上的遗传多样性极为丰富（多态性百分率达99.1%），但同一种内个体之间的遗传多样性均较低（多态性百分率10.4%～24.9%，平均仅为16.8%），其中，峨眉黄连、三角叶黄连的遗传多样性水平较低（多态性百分率分别为10.4%，12.5%），黄连、日本黄连的遗传多样性水平相对较高（19.5%，24.9%）。由于供试材料、分子标记的不同，所得到的结果有一定差异，但均从不同角度揭示了黄连属药用植物较为丰富的遗传多样性，不同种之间存在特有的遗传特性。

一个物种遗传多样性的高低与其分布范围、繁育方式等有关。从物种的分布范围看：黄连主要分布在长江中下游各省市，是黄连属药用植物中用药最广泛、栽培面积最广、产量最大的物种；峨眉黄连常生长在陆峭的岩缝间，主要分布在四川峨眉山脉，居群小而分散，属于狭域种；三角叶黄连仅分布于仅分布于四川峨眉山、洪雅一带，多为栽培，生长区域狭窄；日本黄连为从日本引进物种。从以上分析推断，黄连属药用植物遗传多样性水平与物种的分布区域及小生境有着一定的联系。从繁育方式上看，三角叶黄连染色体为三倍体（2n=3x=27），偶尔有种子结实，但其大多不育，生产上采用“扯秧苗栽秧”的无性繁殖方式进行繁殖^[3]，因此其遗传多样性水平低于种子繁殖物种。

3.2 黄连属常用药用植物的亲缘关系研究 中药材黄连的来源植物除《中国药典》收载的黄连、云连、三角叶黄连之外，我国各地尚有多种黄连属植物如峨眉黄连、西藏黄连、短萼黄连等的根茎作为黄连入药。对于某些种的分类地位无论是形态标记还是分子标记得到的结果是一致的，如云连，但某些种的分类地位颇有争议，争议主要集中在黄连、三角叶黄连与峨眉野连三者的亲缘关系。研究者采用不同方法，多角度对黄连属药用植物的亲缘关系进行研究，早期多采用形态标记，后期引入分子标记，但不同的研究方法得到的结果并非完全一致。形态分类主要以花瓣形状、萼片的形状及宽窄、叶形差异为黄连属植物分类的依据，认为三角叶黄连与黄连亲缘关系更近^[1]。武敬亮采用RAPD分子标记，也认为三角叶黄连与黄连亲缘关系更近。但韩凡等^[8]采用RAPD分子标记与本文采用的SCoT标记，认为三角叶黄连与峨眉黄连亲缘关系更近。

此外，对三角叶黄连的栽培起源争议也颇大，一种认为三角叶黄连为黄连与峨眉野连的杂交种，另一种认为三角叶黄连是峨眉黄连种内多倍化的结果。前者的主要证据为刘晓光^[9]采用DNA条形码研究发现三角叶黄连分别与黄连和峨眉黄连具有较多共有基因型，由此可初步推断三角叶黄连是由黄连和峨眉黄连杂交起源而来。后者主要证据源于黄骥等^[3]对国产黄连属植物的染色体核型分析，表明三角叶黄连为三倍体，对称程度较高，核型为3A型，其染色体大小与峨眉黄连最接近，结合这2个种分布区相重叠的实际，可以推测三角叶黄连是峨眉黄连种内多倍化并以营养繁殖方式固定下来，即三角叶黄连应栽培起源于峨眉黄连。本文的聚类结果支持后一种推测。

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[5]Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted（SCoT） polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Mol Biol Rep， 2009，27（1）：86.

[6]常艳波. 黄连属药用植物RAPD鉴定与亲缘关系研究[D].成都：四川大学，2005.

[7]武敬亮. 4种黄连属（Coptis）植物的RAPD鉴定以及黄连的居群多样性分析[D].南充：西华师范大学，2005.

[8]韩凡，邹嘉欣，宋良科，等. 峨眉黄连及其近缘种的遗传多样性分析[J].安徽农业科学，2012，40（30）：14648.

[9]刘晓光. 基于群体遗传学的黄连属DNA条形码研究[D].济南：山东中医药大学，2012.

[责任编辑 吕冬梅]