脑蛋白水解物溶液的灭活及去除病毒工艺研究

吴晶晶+段洪双

摘 要：目的：研究脑蛋白水解物溶液的灭活及病毒去除的工艺。方法：选择披膜病毒科黄病毒属的猪流行性乙型脑炎病毒（乙脑）、细小病毒科细小病毒属的猪细小病毒（PPV）作为指示病毒，其中乙脑代表有囊膜的核糖核酸RNA），PPV作为无囊膜脱氧核糖核酸（DNA）病毒的代表。模拟生产工艺中的病毒灭活步骤100℃×10min，超滤作为灭活及去除病毒的条件。将病毒分别按照1∶4加入到脑蛋白水解物溶液中，进行高温、浓缩、超滤来灭活及去除病毒。以猪肾细胞（PK-15）细胞培养PPV，以仓鼠肾细胞（BHK-21）培养乙脑，测定病毒滴度。结果：PPV、乙脑通过灭菌，病毒半数组织培养感染剂量（TCID50）分别为6.15log/0.1mL（logs）、5.37log/0.1mL（logs）；去除工艺平均病毒降低系数分别为6.15log/0.1mL（logs）、5.37log/0.1mL（logs）。结论：脑蛋白水解物溶液生产工艺中的高温、浓缩、超滤均可作为病毒灭活及去除的有效工艺。

关键词：脑蛋白水解物；灭活；去除病毒；工艺研究

健康的猪脑组织经复合蛋白酶水解分离得到脑蛋白水解物，其主要含多种人体必须的游离氨基酸及活性小分子多肽，是一种神经保护剂，具有神经营养和神经保护的类似神经生长因子的作用，其中检出游离氨基酸16种，占总含量的75%～80%，临床多用于治疗脑外伤，改善伴有记忆减退及注意力集中障碍等症状的脑血管疾病后遗症，还可辅助治疗脑功能不全、神经系统疾病、精神病性抑郁症及蛋白质消化吸收障碍等[1-2]。由于脑蛋白水解物溶液提取自动物器官，在动物源的选择上或生产过程中可能存在源性病毒及其他污染性病毒。产品的安全性是产品生产的硬性指标，为了保证产品的质量，除了通过严格控制原料的来源和质量外，还应该在生产环节中增加相应的病毒灭活及去除步骤[3]。本次针对生产过程中的一些环节进行研究探讨，找出适合脑蛋白水解物溶液的灭活及去除病毒的工艺，并总结如下。

1.材料与方法[4]

1.1细胞与毒株 猪细小病毒（PPV 9025 C4）株、乙脑病毒株均在成都市动物疫病预防控制中心采购，猪肾细胞、仓鼠肾细胞（BHK-21）作为传代细胞，均由吉林万通药业集团梅河药业股份有限公司实验室存放。本次研究时间为2015年10月至2016年9月。

1.2药品与试剂 灭活前的脑蛋白水解物病毒中间体（哈尔滨三联药业股份有限公司生产，批号141020、141021、141022）；RPMI 1640培养基、抗生素（双抗）、胎牛血清、胰酶等均由合肥博美生物科技有限责任公司提供

1.3仪器 ZCP-50W水套式CO2培养箱，上海喆图科学仪器有限公司；MHY-26435超洁净工作台，北京美华仪科技有限公司；奥林巴斯倒置显微镜CKX53，成贯仪器（上海）有限公司；离心超滤管（0.22μm），上海摩速科学器材有限公司其他常规实验仪器由本人所在实验室提供。

1.4细胞的培养和病毒的增殖 将处于对数生长期的PK-15猪肾细胞用胰蛋白酶消化后接种于96孔细胞培养板，同步接种PPV，放置在37℃、5%CO2培养箱中培养；将仓鼠肾细胞（BHK-21）长成致密单层时接种乙脑，按上述培养条件进行培养，当出现明显的细胞病变后，将其置于-20℃/37℃进行3次反复冻融，收集病毒液。未接种病毒的细胞作为阴性对照细胞。

1.5病毒半数组织培养感染计量的测定 在96孔细胞培养板中测定细胞半数感染量，将传代消化后的细胞稀释成约105～106个/mL后，转移到96孔细胞培养板进行培养，每孔0.2mL；PK-15细胞传代贴壁后再其未进行生长时机加入培养基，接种PPV。将病毒液进行连续10倍的稀释，待BHK-21细胞长成单层后加入培养基，并将乙脑病毒接种，每个稀释度以0.1mL接种6孔，并用0.9%NaCl注射液做阴性对照，放置在37℃、5%CO2培养箱中培养，3小时后更换培养基继续培养，每天观察CPE并记录，按Reed-Muench计算TCID50，病毒的TCID50应大于105；

1.6模拟制备工艺样品 在无菌罩内打开三批样品溶液，每批取3.2mL等量装入两只2mL冻存管中，每管在分别加入PVP和乙脑病毒各0.4mL，混匀后作为高温条件下灭活实验的检测样品，并标记为高温。按生产工艺中的病毒灭活及去除工艺的方式处理样品，将上述标记为高温的加入病毒的样品分别在100℃下灭活10min，做为下一步病毒灭活效果监测的样品。另分别取的三批样品各3.2mL，，等量分装于两只2mL冻存管中同样各加入0.4mL的PVP和乙脑病毒混匀，用超滤柱超滤，并标记，作为超滤病毒灭活及去除实验检测样品。同时做以培养基代替样品溶液做不加入病毒的样品对照。

1.7批量制备工业样品 取新鲜猪脑100kg，按工艺方法处理后得到脱脂脑酚11kg，加水溶解并混合2.9kg的胃蛋白酶、1.9kg胰蛋白酶进行过滤，经柱层析后得到脑蛋白水解物。

1.8测定病毒灭活的滴定度，按1.5的方式将转入96孔细胞培养板上的细胞稀释液加入浓度为2%的血清，BHK-21细胞贴壁生长后弃去培养基，重新加入0.09mL培养基后接种0.01mL在1.6中制备的样品；PK-15细胞以每孔0.09mL同步接种病毒0.01mL傳代至培养板。接种样品分别为：加入病毒并经过病毒灭活及去除（高温/超滤）过程的样品、未加入病毒并经过病毒灭活及去除（高温/超滤）过程的样品、经过（高温/超滤）处理后的病毒对照品、病毒原液、加入培养基的细胞空白对照。除空白对照样品外，其余样品莒南10倍梯度稀释，连续做6个滴度，每个滴度向洪福2次，接种病毒后3h更换培养基。接种乙脑病毒、PPV进行CPE的72h观察。

2.结果

分别测定PPV毒株和乙脑毒株的TCID50，每隔24h通过倒置显微镜观察未接种病毒的和接种病毒后的PK-15细胞和BHK-21细胞，72h内未接种病毒的PK-15细胞和BHK-21细胞形态基本完整，无明显变化；而接种病毒后的PK-15细胞和BHK-21细胞出现的脱落、拉网、圆缩、折光性减弱等明显的CPE。收集接毒48h的PK-15细胞、接毒72hBHK-21细胞各30mL，分装于冻存管中，作为本实验的病毒原液。按Reed-Muench计算出PPV的TCID50，为0.1mL 107.24logs，乙脑的TCID50，为0.1mL 103.36logs，两者稀释的病毒液备用。

模拟工艺对加入病毒的样品进行灭活及去除验证，经高温、超滤后的样品加入培养液进行培养观察，此件对照细胞正常生长。

3.讨论

通过本次研究结果，可以看出病毒灭活及去除的效果受多种因素影响，如何针对这些影响因素作出客观的评价，在将乙脑和PPV病毒添加到脑蛋白水解物溶液中中，高温工艺可以有效的将病毒灭活，超滤可有效将其去除，从而都是病毒丧失了对细胞的感染能力。通过实验的对照组可以看出，经以上方法处理后的男蛋白水解物溶液不再对细胞产生毒性。由此可见，在生产工艺中增加有效的病毒灭活和去除措施是非常必要的，高温灭活和超滤去除病毒的方法在工艺上是可行的，部分学者[5]通过研究发现在超滤工艺的基础上增加了层析工艺，更有利于生产过程中的杂志去除，该项结论值得进一步研究推广和研究。

参考文献

[1] 余燕， 梁蔚阳， 邓锋，等. 脑蛋白水解物对神经细胞损伤修复活力测定方法的研究[J]. 中国现代应用药学， 2016， 33（6）：704-707.

[2] 黄洁， 王孝功， 单敏. 高效液相色谱柱后衍生法对脑蛋白水解物注射液生产工艺的优化研究[C]// 全国色谱学术报告会及仪器展览会. 2015.

[3] 辜正平， 王伯初， 旷瑜. 肝水解肽的制备及其病毒灭活/去除工艺的验证[J]. 中国生物制品学杂志， 2010， 23（1）：95-97.

[4] 李凤霞， 初云海， 黄清玲，等. 脑蛋白水解物溶液的灭活/去除病毒工艺研究[J]. 中国基层医药， 2015， 22（1）：54-56.

[5] 黄洁， 王孝功， 单敏，等. 脑蛋白水解物的提取工艺优化[J]. 中国药房， 2016， 27（28）：3985-3987.

作者简介：吴晶晶，哈尔滨三联药业股份有限公司，主管药师，150025，本科，1983年生人。