小麦黄色素含量、多酚氧化酶活性和1B/1R异位相关基因的分子标记检测

陈泠+高春保+佟汉文+朱展望+刘易科+张宇庆+邹娟+鲍文杰

摘要：利用与黄色素含量、多酚氧化酶（PPO）活性和1B/1R异位系性状相关的分子标记对158份小麦（Triticum aestivum L.）材料进行分析，从而了解其色泽品质状况，并为高白度、低PPO活性小麦育种提供优异亲本资源。结果表明，低PPO活性相关等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a的分布频率分别为57.6%和67.7%，低黄色素含量相关等位变异Psy-A1b和Psy-B1b的频率分别为47.5%和60.1%，高黄色素含量相关等位基因Psy-B1c的出现频率为5.1%，1B/1R异位系的分布频率为21.5%。158份材料中同时携带低黄色素含量、低PPO活性等位变异组合，且为非1B/1R异位系的材料有16份，频率为10.1%，可用于高白度面粉小麦品种的选育。

关键词：小麦（Triticum aestivum L.）；黄色素含量；多酚氧化酶（PPO）活性；1B/1R异位；分子标记

中图分类号：S512.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6050-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.009

Abstract： In order to understand the frequency of allelic variants related to yellow pigment content，polyphenol oxidase （PPO） activity and 1B/1R translocation，158 wheat（Triticum aestivum L.） lines were explored by molecular markers. Through this work，elite wheat lines could be used as parent materials to produce new wheat materials with high whiteness and low PPO activity. The results showed that the frequencies of Ppo-A1b and Ppo-D1a related to low PPO activity were 57.6% and 67.7% respectively. Psy-A1b and Psy-B1b associated with low yellow pigment content were detected with frequencies of 47.5% and 60.1% respectively. The frequency of Psy-B1c for high yellow pigment content was 5.1%. The 1B/1R translocation was found with frequency of 21.5%. Out of all 158 wheat lines，16 elite varieties contained allelic variants of low yellow pigment content， low PPO activity and non-1B/1R translocation were selected，and the frequency of these materials was 10.1%. These materials could be used for the breeding of wheat varieties with high whiteness.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； yellow pigment content； polyphenol oxidase（PPO）activity； 1B/1R translocation； molecular marker

面粉色澤是评价小麦（Triticum aestivum L.）品质的一个重要指标，对面制品的商品性有重要影响。不同地域的人们因对面食种类的喜好不同，在面粉色泽选择上存在差异。如欧洲、美国及中东的披萨以色泽黄亮为佳。中国蒸煮类面食则以色泽白亮为优选，因此白度高的小麦品种更受中国市场的欢迎。

前人的研究结果表明，影响面粉色泽及面制品颜色的因素有黄色素含量、多酚氧化酶（PPO）和脂肪氧化酶（LOX）活性。LOX可催化亚油酸、亚麻酸等一些不饱和脂肪酸，释放出高活性的氧自由基偶联氧化面粉及面制品中的色素进行生物漂白，从而使面粉颜色变白。因此筛选高活性的LOX可筛选白度高的小麦品种[1]。但过高的LOX活性会氧化小麦粉中的维生素A等，造成面粉营养品质降低[2]，同时LOX活性与面团强度、形成时间、稳定时间和延展性呈显著负相关，降低了小麦品质[3，4]。另外，LOX是影响小麦储藏特性的主要因素之一[5]，降低LOX活性有利于延长小麦子粒以及面制品的保存期，提高其商业价值[6-8]。前人研究还证实，LOX活性在面粉储藏过程中丧失较快，且与面粉白度、亮度和黄度间的相关均不显著，不是面粉色泽改良的关键因素[9]。因此在选育高白度小麦品种时，选择LOX活性高的品种对于面粉色泽影响不大，且不利于子粒及面粉的品质和储藏。

小麦黄色素的主要成分是类胡萝卜素[10]，而八氢番茄红素合成酶（PSY）是类胡萝卜素合成的限速酶，直接影响子粒胚乳的颜色[11]。He等[12，13]开发了小麦7AL和7BL染色体上Psy-A1和Psy-B1位点的标记，其中标记YP7A、YP7B-1和YP7B-2可以区分与黄色素含量高低相关的等位变异Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c，并且证实在相同Psy等位基因情况下，非1B/1R异位系的黄色素含量更低，而标记YP7A-2、YP7B-3和YP7B-4可区分Psy-A1c、Psy-B1d和Psy-B1e，但这些等位基因与黄色素含量的相关性目前还不清楚。

PPO活性可引起面粉及面团在加工和贮藏过程中发生褐变，降低面制品色泽。PPO活性的主效QTL位于2AL和2DL染色体上，Sun等[14]已开发出的序列标志位点（Sequence tagged sites，STS）共显性标记PPO18可区分2AL染色体上的Ppo-A1a和Ppo-A1b等位基因。He等[15]开发的互补显性标记PPO16和PPO29可区分2DL染色体上的Ppo-D1a和Ppo-D1b等位变异。

本研究利用PSY、1B/1R和PPO分子标记对湖北省农业科学院部分亲本小麦品种中的等位变异情况进行检测和分布规律分析，并从中筛选低黄色素含量、低PPO活性的非1B/1R异位系小麦品种，用于改良小麦品种面粉色泽，以期筛选出聚合低黄色素含量和低PPO活性相关的多个优异色泽等位变异组合的非1B/1R异位系育种亲本资源，以便培育出适合市场需要的高白度面粉的小麦品种。

1 材料与方法

1.1 材料

158份供试材料选自2015-2016年湖北省农业科学院粮食作物研究所亲本圃，包括国内品种（系）116份，湖北省品种（系）25份，CIMMYT材料14份，其他国外材料3份。

1.2 基因组DNA的提取

于2016年4月初在大田中取材，每个品种各选取3株材料，剪取约3 cm叶片装于2 mL离心管中（尽量剪碎，方便后续粉碎）。取材完毕后，每管加2～3粒钢珠，500 μL CTAB溶液，100 μL三氯甲烷与异戊醇混合溶液（体积比为24∶1，下同）进行振荡粉碎（30 r/min，1 min），然后65 ℃水浴30 min，室温放置15 min。在通风橱中加入400 μL三氯甲烷与异戊醇混合溶液，涡旋仪振荡30 s，12 000 r/min离心7 min，吸取上清200 μL于1.5 mL离心管中，加入2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，颠倒数次混匀后12 000 r/min离心2 min。沉淀经70%乙醇洗涤2～3次后溶于100 μL TE中，-20 ℃备用。每个品种若3株材料的分子标记检测结果不一致，则再取3株材料进行检测，以重复次数最多者为最终检测结果。

1.3 分子标记检测

试验所用分子标记的相关信息见表1。PCR反应体系为20 μL，含16 μL ddH2O、2 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus）、0.4 μL dNTPs（各10 mmol/L）、0.2 μL上游引物（20 μmol/L）、0.2 μL下游引物（20 μmol/L）、0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和1 μL模板DNA（50～100 ng），在普通PCR扩增仪（美国ABI Veriti型）中进行反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后利用凝胶成像系统拍照分析。YP7B-1分子标记的结果经12%聚丙烯酰胺电泳后银染后拍照分析。

2 结果与分析

2.1 1B/1R异位系的分子标记检测

非1B/1R异位系对面粉白度具有正向作用。Scar标记可检测1B/1R异位系，扩增出1 500 bp的特征条带。经PCR检测，供试材料中有34份为1B/1R异位系（部分结果见图1A），分布频率为21.5%。湖北省材料和CIMMYT材料中1B/1R异位系频率很低，仅为8.0%和7.1%（表2）。

2.2 PPO活性基因的分子标记检测

共显性标记PPO18可检测低PPO活性基因Ppo-A1b和高PPO活性基因Ppo-A1a，分别扩增出876 bp和685 bp的特征条带。在158份供试材料中，有91份材料含低PPO活性基因型Ppo-A1b（部分结果见图1B），频率为57.6%；另外67份材料都获得了685 bp片段，为高PPO活性等位变异Ppo-A1a。

PPO16和PPO29为互补显性标记，分别检测低PPO活性基因Ppo-D1a和高PPO活性基因Ppo-D1b，获得713 bp和490 bp的特征条带。有107份材料为低PPO活性基因型Ppo-D1a（部分结果见图1C），频率为67.7%，另外51份材料均为高PPO活性等位变异Ppo-D1b（部分结果见图1D）。值得一提的是14份CIMMYT材料全部含有低PPO活性等位基因Ppo-D1a。

2.3 黄色素含量相关基因的分子标记检测

共显性标记YP7A可扩增低、高黄色素含量基因Psy-A1b和Psy-A1a，分别获得231 bp和194 bp的特征条带。供试材料中，75份材料为低黄色素含量基因型Psy-A1b型，频率为47.5%；82份材料为Psy-A1a（部分结果见图2）。但宁6E125未扩增出条带，该材料DNA用标记YP7A-2进行检测，也未扩增出片段大小为1 001 bp（Psy-A1c）或1 686 bp（Psy-A1a/Psy-A1b）的条带，推测该材料在此位点具有不同的等位基因型。

共显性标记YP7B-1可检测低、高黄色素含量Psy-B1b和Psy-B1a基因型，分别扩增出156 bp和151 bp的特征条带。共有95份材料为低黄色素含量Psy-B1b基因型，频率为60.1%；另外63份材料为高黄色素含量Psy-B1a基因型（部分结果见图3）。显性标记YP7B-2可扩增高黄色素含量Psy-B1c基因型，获得428 bp的特征条带。供试材料中仅有8份材料为高黄色素含量Psy-B1c基因型，频率为5.1%（部分结果见图4）。

2.4 聚合优异色泽等位基因材料的筛选

低PPO活性等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a为优异等位基因；低黄色素含量等位基因Psy-A1b和Psy-B1b，且不含Psy-B1c的为优异等位基因；在相同Psy等位基因条件下，非1B/1R异位系材料的黄色素含量更低，即非1B/1R異位系的为优异材料。经分子标记检测，158份供试材料中含有低PPO活性优异等位组合Ppo-A1b/Ppo-D1a的材料有64份，分布频率为40.5%，湖北省材料和CIMMYT材料中该优异组合均高于总体水平，频率分别为46%和50%。含有低黄色素含量的优异等位基因组合Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c的材料有47份，分布频率为29.7%，湖北省材料和CIMMYT材料中该组合频率分别为56%和50%，是总体水平的1.7～1.9倍。同时携带PPO、低黄色素优异等位基因组合，且为非1B/1R异位系的材料有16份，组合频率为10.1%，湖北省品种中优异等位基因组合频率为16%，而CIMMYT材料优异等位基因组合频率为28.6%，约为总频率的2.8倍，湖北省品种的1.9倍。

3 小结与讨论

利用黄色素含量、PPO和1B/1R异位系相关基因分子标记对158份小麦品种（系）进行色泽相关基因型的分析，结果显示这些标记引物扩增效果好，条带清晰，可应用于分子标记检测。值得注意的是，用標记YP7A和YP7A-2在宁6E125品种中未检测到Psy-A1a、Psy-A1b或Psy-A1c基因型。Psy-A1c基因型是在CIMMYT材料中发现的[13]，目前用标记YP7A-2在国内材料中未检测到Psy-A1c基因型[17，18]，推测宁6E125中Psy-A1位点存在其他不同的等位基因，有待下一步试验证实。另外，用标记YP7B-1和YP7B-2检测发现，含Psy-B1c基因型的8份材料同时也携带Psy-B1b等位基因。胡凤灵等[18]发现含Psy-B1c基因型的材料也同时含有Psy-B1a或Psy-B1b等位基因，其具体原因有待进一步研究。

等位基因型Ppo-A1b和Ppo-D1a与低PPO活性相关。国内研究发现Ppo-A1b分布频率为43.8%～53.8%[17-21]，但新疆材料Ppo-A1b频率较低，分布频率为16.26%～38.00%[21-23]。国内材料Ppo-D1a分布频率范围为58.4%～74.6%[1，17，19，21]，而新疆材料中Ppo-D1a出现频率最低为48.0%[21]，最高达86.8%[22]，差异很大。本研究结果显示，158份材料中，Ppo-A1b分布频率为57.6%，Ppo-D1a频率为67.7%，与前人报道的国内研究结果基本一致。有趣的是，14份CIMMYT材料全为优异色泽等位基因Ppo-D1a基因型。

等位基因型Psy-A1b、Psy-B1b被证明与低黄色素含量有关，Psy-A1a、Psy-B1a和Psy-B1c则与高黄色素含量有关。国内研究发现，Psy-A1b基因型出现频率偏低，频率范围为10.8%～42.8%[18，20，21，24-26]，新疆材料中Psy-A1b频率很低，为7.70～16.25%[21-23]；仅四川省材料中Psy-A1b频率稍高，为53.3%[17]。等位基因Psy-B1b和Psy-B1c分布频率研究较少，Psy-B1b频率为52.9%～56.2%[17，18]；Psy-B1c出现频率很低，最高14.0%[18]，最低为四川省的1.9%[17]。本研究结果显示，158份材料中Psy-A1b分布频率为47.5%，Psy-B1b频率为60.1%，Psy-B1c频率为5.1%，即与低黄色素含量相关基因型Psy-A1b和Psy-B1b出现频率高于全国平均水平。而湖北省材料和CIMMYT材料中Psy-A1b和PsyB1b的分布频率更高，湖北省材料分别为68.0%和76.0%，CIMMYT材料分别为64.3%和71.4%，且都不含有与高黄色素含量相关的基因型Psy-B1c。

国内材料1B/1R异位系的分子检测发现，其频率范围为10.4%～34.3%[20，21，27，28]，甘肃省材料中1B/1R异位系的分布较多，为33.60%～45.19%[1，24]。本研究发现，158份材料中1B/1R的出现频率为21.5%，与前人结果一致。而湖北省材料和CIMMYT材料中1B/1R的出现频率很低，仅为8.0%和7.1%。

158份材料中低PPO活性等位基因组合 Ppo-A1b/Ppo-D1a的出现频率为40.5%，与前人研究结果相似[17，19]。低黄色素含量等位基因组合Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c的材料较少，而同时含低PPO活性和低黄色素含量等位基因组合，且为非1B/1R异位系的频率仅10.1%，湖北省材料和CIMMYT材料中优异色泽等位基因分布频率高于国内平均水平。引人关注的是，湖北省材料和CIMMYT材料中Ppo-A1b/Ppo-D1a和Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c组合出现频率差异不大，但CIMMYT材料中聚合这两种组合的出现频率却很高，频率为28.6%，是湖北省材料的1.9倍，可见湖北省材料需要提高多个优异等位基因组合的出现频率，而对于国内材料来说，不仅要提高各优异色泽等位基因的出现频率，更要加速多个优异色泽等位基因的聚合。

通过分子标记筛选，158份材料中同时携带低PPO活性和低黄色素含量等位基因组合，且为非1B/1R异位系的材料有16份，分别为04012、04020、04103、09P137、川麦43、川麦50、神麦2000、紫小麦（1135）、华2128、鄂麦14、鄂麦15、鄂麦16、10H0319、10H1129、10H1193和14FHBSN6418，这些材料可用于高白度面粉小麦品种的选育。

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