碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶水解羊骨粉的工艺研究

张琪，甄守燕，霍乃蕊

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶水解羊骨粉的工艺研究

张琪1，甄守燕1，霍乃蕊2*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

[目的]碱性蛋白酶和复合蛋白酶为水解羊骨粉制备胶原多肽效果最好的两种单酶，为进一步提高酶解效果。[方法]以羊骨粉为原料，进行双酶水解，比较同步水解与顺序水解的效果，确定最优水解工艺。[结果]同步水解AB2组合的水解效果最优，各水解评价指标均显著高于单酶水解和顺序水解(P<0.05)，与顺序水解相比不显著(P>0.05)，但优于顺序水解且大大节省了时间，其水解工艺为：底物浓度9%，碱性蛋白酶和复合蛋白酶的加酶量分别为5.00%和4.25%，起始pH 8.5，50 ℃水解5 h时，水解度达29.79%，氨基酸态氮28.13%，多肽生成量110.43 mg·g-1，短肽得率73.88%。[结论]双酶同步水解羊骨粉提高酶解效果的同时，也为充分水解羊骨制备胶原多肽提供了试验支持。

碱性蛋白酶； 复合蛋白酶； 羊骨粉； 胶原多肽； 双酶水解

我国羊肉生产和消费比重占世界首位，但羊骨的相关研究和开发却落后于发达国家。羊骨营养丰富，氨基酸组成均衡，必需氨基酸含量高，其蛋白质含量可与等量常见的鲜肉媲美[1]，骨胶原蛋白主要为三螺旋结构，不易被生物体利用，酶解会使其转变为肽和游离氨基酸[2]，多肽在人体肠道中的吸收率远远高于蛋白质，且具有促进人体脂质代谢和对矿物质的吸收、降低血液胆固醇浓度、促进机体免疫功能等生理功能[3]。课题组先期研究，筛选到碱性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶是水解羊骨粉效果最好的3种酶，并对这3种单酶的水解工艺进行了优化。研究表明多肽的肽链越短，其生物活性越强[4]，双酶作用时，由于作用位点增多，比单酶水解可获得更多的短肽。水解度、多肽生成总量、短肽得率和游离氨基态氮是评价蛋白质水解程度的常用指标，本课题组研究结果表明4指标之间呈正相关[5]。为了进一步提高骨胶原水解程度，本研究拟以碱性蛋白酶和复合蛋白酶对羊骨粉进行水解，测定其与酶解相关的指标，比较同步水解和顺序水解的水解效果，确定双酶水解的最佳工艺条件，为羊骨粉的高值利用提供理论依据。

1 材料

1.1 原料及试剂

新鲜羊骨购买于山西太谷县屠宰场(-20 ℃贮存备用)。碱性蛋白酶(A) (酶活≥200 U·mg-1，Solarbio)、复合蛋白酶(B)(酶活≥120 U·mg-1，Solarbio)；铬黑T(天津市北辰方正试剂厂)；三乙醇胺(天津市北辰方正试剂厂)；对苯二甲醛(OPA)(天津市天力化学试剂有限公司)；福林酚(天津市大茂化学试剂厂)。

1.2 主要仪器与设备

802型索式抽提器(天津市玻璃仪器厂)；722G可见分光光度计(上海精密仪器有限公司制造)；STARTER 3100 pH计(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；Neofuge23R台式高速冷冻离心(上海力申科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 羊骨粉制备

羊骨→清洗→高压蒸煮(125 ℃，30 min)→水煮去脂→干燥(111 ℃，6 h)→高速万能粉碎机粉碎→过80目筛。

2.2 双酶水解的相关工艺

2.2.1 碱性蛋白酶和复合蛋白酶同步水解

碱性蛋白酶(A)[6]以及复合蛋白酶(B)的响应面法优化得到的酶解工艺条件[7]下底物浓度均为9%，A和B的添加量分别为4.25%和5.00%，而酶解时间、温度、pH值不同。因此设计试验如表1所示，酶解完成后，5 000 r·min-1离心15 min，取上清测定相应的指标。

2.2.2 碱性蛋白酶和复合蛋白酶顺序水解

在最优水解工艺条件下，因碱性蛋白酶(A)的最佳水解温度为45 ℃，复合蛋白酶(B)的最佳水解温度为55 ℃，所以顺序水解时，先由A酶在其最优工艺条件下水解一定时间，再调整至B酶的最优工艺pH和温度下继续水解，由于时间因素对碱性蛋白酶有显著的影响[10]，所以控制总水解时间为625 min，水解时间比分别为：1∶3、3∶5、1∶1、5∶3、3∶1，进行酶解和指标测定。

表1 羊骨粉碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶同步水解设计表

Table 1 Simultaneous hydrolysis of sheep bone powder by alcalase and protamex

分组Testgroup时间/minTime温度/℃TemperaturepHAB1300459.0AB2300508.5AB3300508.0AB4300557.5AB5325459.0AB6325508.5AB7325508.0AB8325557.5A300557.5B325459.0

2.3 指标测定

水解度的测定采用OPA(邻苯二甲醛)法；游离氨基酸态氮的测定采用中性甲醛滴定法；短肽得率的测定采用TCA法(三氯乙酸可溶性氮法)；游离钙含量的测定采用EDTA滴定法；多肽生成总量的测定，测定的是分子量低于10 000 D且不被TCA所沉淀的多肽[8]。测定时以上各指标均做3次重复。

2.4 数据分析

所有试验数据首先采用excel进行数据的初步分析及处理，然后采用SigmaPlot 10.0 软件进行显著性分析,并绘制相关的柱形图。

3 结果与分析

3.1 同步水解各指标测定结果

在底物浓度为9%，碱性蛋白酶(A)和复合蛋白酶(B)的添加量分别为4.25%和5.00%条件下进行双酶同步水解，时间、温度和pH对水解效果和游离钙含量的影响如图1所示。

由图1可见，碱性蛋白酶和复合蛋白酶同步水解羊骨粉时，水解度，氨基酸态氮，多肽生成量，短肽得率，游离钙含量的测定结果大体上均高于同等条件下碱性蛋白酶和复合蛋白酶单酶水解的测定结果。这个测定结果，与本课题组研究的评价蛋白质水解程度的常用指标之间呈正相关理论一致，说明这些指标在反应酶解程度上是一致的，具有强相关性。同时，AB2组的各项水解指标，除游离钙含量外，均显著高于其他各个组和单酶水解的各项指标(P<0.05)，分析AB2组的游离钙含量没有理论值大的原因是，由于从骨组织释放的Ca2+可能与酶解释放出来的多肽发生了螯合作用[9]。所以，最终选择的碱性蛋白酶和复合蛋白酶的同步水解的复合水解方式为：在底物浓度为9%、温度为50 ℃、pH为8.5的条件下同时加入碱性蛋白酶(5%)和复合蛋白酶(4.25%)。

图1 碱性蛋白酶(A)和复合蛋白酶(B)同步水解时不同效果比较Fig.5 Comparison of different simultaneously hydrolyzing group by alcalase(A) and protamex(B) 注：不同字母表示同一指标内差异显著(P<0.05)Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same index

图2 碱性蛋白酶(A)和复合蛋白酶(B)顺序水解时不同效果比较Fig.2 Comparison of different sequentially hydrolyzing group by alcalase(A) and protamex(B)

3.2 碱性蛋白酶和复合蛋白酶顺序水解的测定结果

碱性蛋白酶和复合蛋白酶顺序水解的测定结果如图2所示。

由图2可见，碱性蛋白酶与复合蛋白酶顺序水解时间比为1∶3时，水解度，氨基酸态氮，多肽生成量，短肽得率均显著高于其他组的对应指标(P<0.05)。而游离钙含量却是时间比为3∶1的组显著高于其余组，说明在酶解的过程中，有可能有一些Ca2+被多肽或氨基酸螯合，这与顺序水解的结果是一致的，说明游离钙含量不能作为判定水解效果的指标。

3.3 同步水解与顺序水解结果比较

顺序水解与同步水解的试验结果相比，同步水解AB2组水解效果最优，其水解度可达29.79%，氨基酸态氮28.13%，多肽生成量110.43 mg·g-1，短肽得率73.88%；而顺序水解先碱性蛋白酶后复合蛋白酶，水解时间比为1:3时效果最优，水解度达29.67%，氨基酸态氮26.37%，多肽生成量109.71mg·g-1，短肽得率73.36%。两者相比，顺序水解各指标均不及同步水解，两者差异不显著(P>0.05)，但同步水解大大节省了水解时间。总之，羊骨粉碱性蛋白酶和复合蛋白酶同步水解的工艺优于顺序水解。

4 讨论

因酶解畜骨得到的多肽的营养丰富，所以是近年来专家学者研究的热点。白艳红、谢静、丁小燕等[11～13]研究了复合蛋白酶酶解猪骨、鸡骨的最佳工艺，张群飞[14]研究了碱性蛋白酶酶解虾籽的工艺条件。以上学者均研究了单酶的水解效果，而采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶水解的研究甚少。本试验采用同步水解和顺序水解的方式对羊骨粉进行了酶解，从而制得了相对分子质量更小的短肽。

同步水解的各水解指标均显著高于单酶水解，水解度相比提高了1.67%，氨基酸态氮提高了1.65%，多肽生成量提高了26.61%，短肽得率提高了31.24%，游离钙含量提高了20.64 mg·100 g-1，这与不同蛋白酶水解畜骨，由于互补作用，可增大蛋白酶对底物的水解的原理是一致的，且各水解指标之间呈正相关的关系，这与本课题研究的表明水解效果的水解指标之间的关系也是一致的，另外通过试验表明，游离钙含量不能作为判断酶解效果的指标，因为骨组织释放的Ca2+可能与酶解释放出来的多肽发生了螯合作用，形成了钙螯合胶原肽。

此外，试验结果表明，顺序水解需水解625 min而同步水解只需要作用300 min，此时同步水解的水解效果还优于顺序水解，另外同步水解还具有一次投酶，操作简单的优点，所以，采用同步水解的方法水解羊骨骨粉制备胶原短肽的方法更可靠。

5 结论

碱性蛋白酶和复合蛋白酶双酶同步水解AB2组合的水解效果最优，各水解指标均显著高于单酶水解和顺序水解(P<0.05)，此时的最佳水解工艺为：起始pH 8.5，碱性蛋白酶和复合蛋白酶的加酶量分别为5.00%和4.25%，底物浓度为9%，50 ℃水解5 h。同步水解还有操作简单，节省时间等优点。另外，研究表明，游离钙含量不能作为酶解骨粉的指标。总之，通过以上试验可以说明，双酶同步水解羊骨粉提高酶解效果的同时，也为充分水解羊骨制备胶原多肽提供了试验支持。这对于日益追求可持续发展的今天来说，运用此技术可以更好得利用我国庞大的骨资源，为我国提供良好的经济效益和社会效益。

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(编辑：马荣博)

The Study on the Hydrolysis of Alcalase and Protamex to Sheep Bone Powder

Zhang Qi1, Zhen Shouyan1, Huo Nairui2*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]Alcalase and protamex were the best enzymes for collagen polypeptide that hydrolyzed from the sheep bone through screening.[Methods]This research compared the effect of sequentially and simultaneously hydrolyzing to further improve the enzyme effect and to determine the best condition for hydrolyzing.[Results]This experiment showed that:The group of simultaneously hydrolyzing AB2 that the hydrolysis of indicators were extremely higher than the single (P<0.05) compared with sequentially hydrolyzing is insignificant(P>0.05) but saved time extremely in condition of 9% substrate,5% (E/S) alcalase and 4.25% (E/S) protamex,initial pH 8.5,50 ℃,5 h. From researching that the degree of hydrolysis,amount of amino-acid nitrogen,amount of formed polypeptides,the obtaining rate of oligopeptides partly researched to 29.79%, 28.13%, 110.43 mg·g-1and 73.88%.[Conclusion]To sum up,double enzyme simultaneously hydrolyzing not only could improve the enzyme effect but also could provide experimental support for the preparation of collagen polypeptide from sheep bone.

Alcalase， Protamex， Sheep bone， Collagen peptide， Double enzyme hydrolysis

2016-07-17

2016-09-23

张琪(1993-)，女(汉)，山西临汾人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术

*通信作者：霍乃蕊，教授，博士，Tel:0354-6289236;E-mail:tgnrhuo@163.com

国家自然科学基金(31201347)；山西省回国留学人员项目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0121-05