分支杆菌Rv0024诱导生物膜的形成和抗细胞壁作用研究进展

刘 巍,李 东,曾范利，李健明，时 坤，宗 颖，冷 雪，王春凤，杜 锐,3*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；3.吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春 130118)



分支杆菌Rv0024诱导生物膜的形成和抗细胞壁作用研究进展

刘 巍1,李 东1,曾范利2，李健明2，时 坤2，宗 颖2，冷 雪2，王春凤1，杜 锐2,3*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；3.吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春 130118)

多药耐药结核菌和广泛耐药结核菌的出现，使得结核病成为全球第二大传染病。而生物膜的形成在几个人类病原体发病机制作用是公认的。然而，在结核分支杆菌感染情况下生物膜的作用和生物膜形成的遗传因素仍然存在很大程度上的未知。论文通过查阅大量外文文献阐述了细胞壁在结核分支杆菌中的耐药机制，并且发现生物膜中 Rv0024为新的 NlpC/p60蛋白质家族的一员，通过结核分支杆菌 Rv0024异位表达，编码一个假定的肽酶，并且随着抗结核药物异烟肼和吡嗪酰胺耐药性的出现,生物膜形成的Rv0024也显著增加。Rv0024可能在初次感染过程中发挥了关键作用，参与宿主细胞的耐药性产生。因此，Rv0024可作为治疗肺结核的一个潜在的药物靶标进行深入研究。

分支杆菌；Rv0024；生物膜；耐药性

结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的慢性感染性人兽共患病。根据世界卫生组织(WHO)的报告，全世界大约有1/3的人口感染了结核，并且每年约有800万例新增的肺结核病例[1]。随着抗结核化学药物的使用，细菌已经进化出了几种耐药性机制应对大多数药物。这些耐药菌被分为多药耐药(multidrug resistance,MDR)和广泛耐药(extensively drug resistantce,XDR)的结核分支杆菌菌株。多药耐药菌株至少耐受异烟肼(isonicotinic acid hydrazide,INH)和利福平(rifampicin,RIF)；广泛耐药菌株是对异烟肼和利福平耐药，此外对任何氟喹诺酮类药物二线注射药物至少耐受1种[2]。研究表明，结核菌耐药机制包括富含脂质的疏水的细胞壁结构的存在，变异能力的药物靶位点和细胞壁中特定的药物外排泵的大量存在等[3]。许多细菌能产生生物膜，生物膜是表面附着在气-液界面形成的膜，是细菌在不良环境中生存的保证[4]。生物膜相关感染是更持久的，能够对大多数抗生素耐药，并产生更顽固的宿主免疫等。例如，铜绿假单胞菌生物膜的生长形成囊性纤维化结构。尿道致病性大肠埃希菌，引起尿路感染，已被证明在小鼠生物膜中形成。霍乱弧菌、葡萄球菌、链球菌及其他一些细菌病原体已经形成生物膜[5-6]。鉴于全球抗结核药物的耐药性的惊人上升，新的药物靶标的识别对结核病未来的控制是至关重要的。

1 结核分支杆菌Rv0024基因结构学分析

Rv0024编码肽链内切酶，被发现是Rvmc4操纵子的一部分(webtb.org数据库)[7-8]。这个操纵子的功能尚不清楚。操纵子存在其他未知的基因，如Rv0024、Rv0025、Rv0026。Rv0025是一个保守的假定蛋白，与Rv0739具有很高的同源性。基于Web的比较基因组学工具的功能分析搜索表明，Rv0739编码一种膜蛋白调节生物被膜支持蛋白[9]。进一步的分析表明Rv0024域的N末端假定NlpC-p60肽链内切酶结构域的存在。序列同源性分析表明，存在一个保守的序列“195- FDCSGLVQW-203”，这是内肽酶家族，参与调节细胞壁肽聚糖水解酶活性，多序列比对和BLAST结果显示70%以上的蛋白质序列存在同源性，并且与溃疡分支杆菌假想蛋白发挥相同的导致皮肤溃疡的发病机制[10]。

2 Rv0024诱导生物膜的形成及抗结核药物作用

分支杆菌属的耻垢分支杆菌、牛分支杆菌、海分支杆菌及其他物种生物膜形成的有关方面已被确定。然而，在遗传条件和分子方向，生物膜的形成在感染结核分支杆菌中起到的作用没有得到很好的研究。初步研究表明，在使用异烟肼和利福平治疗药物耐受性结核分支杆菌7 d后耐药性比例显著[11]。此外，在感染豚鼠肉芽肿抗结核药物治疗后发现细菌耐药性的微团聚体。一些研究已经表明，结核分支杆菌细胞壁的脂质主要是负责生物膜的形成。在耻垢分支杆菌缺乏突变Msmeg-1529水解酶，lsr2或霉菌酸生物合成缺陷是形成生物膜受损与耐药性有关。此外，哺乳动物细胞组成的分泌/输出蛋白操纵子对细菌细胞表面性质起到改变和维护的作用，从而改变表型性状如菌落形态、生物膜的形成[12]。总之，结核分支杆菌参与细胞壁的生物合成途径似乎对生物膜的形成是很重要的。它已经表明，结核杆菌可形成生物膜。这些体外生物膜被证明是富有自由分支菌酸同时存在耐药细胞[13-18]。

通过其他细菌的研究表明，在单核细胞增生李斯特菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌NlpC/p60蛋白家族在细胞壁动力学中有广泛的作用[20]。肽聚糖水解活性蛋白酶编码家族，帮助细胞壁重组和细胞分裂。与结核分支杆菌基因组的多序列比对表明，有5种蛋白的存在，即Rv0024、Rv1477、Rv1478、Rv1566c及Rv2190。研究表明，删除Rv2190后体内和体外细菌的生长均受损，脂质成分改变，菌落形态改变及对细胞壁作用剂如溶菌酶的敏感性下降，表明其在细胞壁的装配和生长中发挥作用[21]。复苏促进因子相互作用的合作伙伴(RipA)由Rv1477编码，已被确定为室间隔形成及对细胞壁作用抗生素的耐药性产生的一个必要因素。同样，另一种蛋白属于同一操纵子Rv1478(RipB)对肽聚糖重塑亲和力发挥作用。有报道发现，Rv1566c编码非催化肽聚糖[22]，在Msm中与生物膜的形成，与宿主细胞的黏附，改变菌落形态有关。入侵检测的情况下，观察无显著差异。这些生物膜被认为是通过抗细胞壁作用而发挥作用的抗结核药物。

MsmRv0024的表达不改变细胞形态并且MsmRv0024表达增加薄膜的形成，psmt3和MsmRv0024菌株在没有吐温-80的培养条件下能形成生物膜。MsmRv0024在抗生素存在的情况下有更多生物膜形成。由于细胞表面疏水性是决定细胞黏附特性的重要因素，在生物膜形成和抗药性中起重要作用，查阅文献发现MsmRv0024的疏水性在抗生素治疗后不发生改变。psmt3和 MsmRv0024在存在及不存在异烟肼和吡嗪酰胺的Sauton液体介质中生长5 d[23-25]。然后计算每个细胞的聚集指数计算聚集细胞与分散细胞的比率。通过比较上清与培养前初始值甲苯吸收测定(OD 595 nm)得到疏水性的比率，我们发现在类似的条件下MsmRv0024 与psmt3相比疏水性指数有约40倍的增长(P<0.01)，表明MsmRv0024生物膜形成可能是由于表面疏水性增加。

结核分支杆菌具有抗环境压力和抵抗抗菌药物包括抗生素的能力。耐药性出现的各种机制已逐渐被发现，生物膜的形成便是其中之一。然而，关于生物膜的形成和导致耐药性的遗传因素研究甚少。在体外条件下发现几个分支杆菌菌株存在多细胞群体聚集现象，并且生物膜缺陷的突变体被发现有受损的侵袭迹象，随着疾病发展生物膜被作为药物耐药的持久抗药安全住所[9-10，12]。研究表明结核分支杆菌的Rv0024含有在结核分支杆菌中高度保守的NlpC/p60域，参与生物膜的形成，在初步形成感染时有所帮助，是一种重要的毒力因子。结核分支杆菌CDC1551、牛分支杆菌和海分支杆菌的基因组也包含Rv0024同源基因，但没有出现同源基因在Msm基因组改变而导致表型变化，这表明重组Msm应变会导致的Rv0024异位表达。

肽聚糖水解酶在细胞壁代谢和肽聚糖降解过程中发挥重要作用，在肽聚糖循环和细胞分离中有重要的作用[18]。已发现结核分支杆菌脂质在致病中起重要作用，主要是改变了形态，如细胞聚集模式。研究表明Rv0024可能是通过改变分支杆菌细胞壁脂质与细胞壁组件及细菌复制来发挥作用。以往的研究已经表明，删除结核分支杆菌的另一个相同的水解酶家族成员Rv2190，导致结核菌变异，在细胞分裂中细胞壁的位移和分隔过程也受影响[20]。此序列已在许多NlpC/p60家族成员包括Rv1566c和Rv2190C中观察到，但在Rv0024却未出现[25]。在Rv0024中缺失也可能是MsmRv0024应变没有侵入宿主细胞的原因，如RGD序列介导的初始结合到细胞表面的整合素受体[26]。

研究表明，MsmRv0024能在固体、液体与空气的界面形成生物膜。脂质丰富的细胞外基质包括丰富的分枝菌酸和其他脂肪，通常是在生物膜中的细菌细胞壁形成[18]。因此，可以推测为增强生物膜的形成可能增加聚合物分泌物或MsmRv0024细菌细胞壁相关的脂质成分改变。如蜡样芽胞杆菌的CwpFM肽酶，这表明NlpC/p60域编码蛋白参与生物膜的形成[25]。

细菌黏附到宿主细胞是宿主细胞感染建立的关键步骤。当肺上皮细胞表面感染1 h后MsmRv0024黏附性增加，此数据进一步支持其作用是生物膜和细胞黏附肽的形成。有研究表明，蜡样芽胞杆菌CwpFM和P60单增李斯特菌分别参与增加HeLa细胞和肠细胞的黏附性[26]。然而，MsmRv0024应变与对照菌株相比侵袭力增强可能是由于缺乏Rv0024蛋白RGD域。

耐药性与生物膜的形成是密切相关的。MsmRv0024生物膜的发现，即使长期暴露于INH和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)产生耐药后，两细胞壁的特异性抗结核药物对脂肪酸合成酶的作用复杂。结核分支杆菌和链球菌Rv1477 p60家族蛋白的缺失增加对环丙沙星、溶菌酶及其他抗生素的敏感性[22-23]。抗生素耐药性生物膜的作用是依赖于诸如限制渗透等多重因素的影响及增长率下降和耐药基因的表达[24]。抗生素的耐药性增加，可能是由于防渗屏障MsmRv0024生物膜的形成，这可能会阻碍渗透抗生素。这样的MsmRv0024株对INH和PZA长期治疗后耐药可以解释为由于生物膜的形成，是一种抗药性种群的避风港。inhA基因，可编码一种载体蛋白还原酶，有阻断脂肪酸合成酶复合物的形成抑制分支菌酸合成的作用[25]。inhA基因缺失会导致霉菌酸酯或血脂的变化，这决定了生物膜形成能力[14]。同样，pncA编码吡嗪酰胺酶也被称为抑制脂肪酸合成酶[26]。未来的研究方向，可以从建立生物膜的形成和突变的靶基因与导致抗生素耐药性之间的关系入手。

细胞表面疏水性是决定细菌黏附到宿主细胞的关键因素[20]。结核菌增加表面上的黏附力导致形成生物膜和耐药性。不像其他的细菌如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌抗菌药物治疗的疏水性下降。这种增加表面疏水性可能会导致更多的生物膜形成，细菌通过表面黏附，从而形成一个不透水层的聚集在细胞外基质内的聚集的细菌阻遏了抗生素扩散通过。这与之前的发现，增加链球菌表面疏水性分离株耐药性直接相关。总之，Rv0024为结核分支杆菌NlpC/p60蛋白家族的第5成员主要参与生物膜的形成和耐药性。

3 展望

结核病(肺结核)的发生对全球经济和人类健康造成了巨大的威胁，全球估计每年有1 000万患者。它也被列为传染病中第二大死亡因素，每年约有130万人死亡，对人类健康和畜牧业的发展造成了巨大的经济损失。随着目前一线药物的使用，结核病的发病情况曾一度缓解，但近几年广泛耐药和多药耐药结核菌的出现，结核病重新又成为了威胁人类健康的重大疾病[18-19]。本文通过查阅和阅读大量外文文献及分析相关试验验数据，阐述了细胞壁对耐药结核分支杆菌的作用机制，对结核分支杆菌基因组的Rv0024基因结构学分析推测耻垢分支杆菌Rv0024的表达可能不改变细胞形态。同时，Msm Rv0024表达增加了薄膜和生物膜的形成，推测生物膜的形成导致耐药性产生的原因可能是由于膜的疏水性的改变。Rv0024为结核分支杆菌NlpC/p60蛋白家族的第五成员，推测其主要参与结核分支杆菌生物膜的形成和耐药性产生。因此，Rv0024可作为一个新的药物靶点进行深入研究，为抗结核药物的研发和结核病的治疗开辟一个新的方向。

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Progress on Rv0024 Induced Biofilm Formation and Resistance against Cell Wall Acting inMycobacterium

LIU Wei1,LI Dong1,ZENG Fan-li2,LI Jian-ming2,SHI Kun2,ZONG Ying2, LENG Xue2,WANG Chun-feng1,DU rui2,3

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China; 3.JilinProvinceSikaDeerProductionandApplicationLab,Changchun,Jilin,130118,China)

Along with the emergence of multidrug-resistant tuberculosis and extensively drug-resistant tuberculosis,tuberculosis has become the world's second largest infectious disease.Role of biofilms in the pathogenesis of several human pathogens is well established.However,in case ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) infection,the role of biofilms and the genetic requirements for biofilm formation remains largely unknown.In this paper,we refer to a large number of foreign literature and expound the resistance mechanism of cell wall inMycobacteriumtuberculosis,discovery of Rv0024 as a member of the new NlpC/p60 protein family,the expression of MTB Rv0024,encoding a putative peptidoglycan amidase.Along with the emergence of drug resistance and antituberculosis drug isoniazid and pyrazinamide,the biofilm formation of Rv0024 also increased significantly.Rv0024 may play a critical role in initial infection process,adherence to host cells and drug resistance.Thus,Rv0024 may be considered as a potential drug target for the treatment of tuberculosis.

Mycobacterium;Rv0024; biofilms; antimicrobial resistance

2017-01-12

国家自然科学基金项目(31372436)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204028NY)；吉林省科技厅科技支撑计划项目(20160209006YY)；吉林省科技厅产业技术创新战略联盟项目(20140309018YY)

刘 巍(1990-)，男，吉林白城人，硕士研究生，主要从事经济动物疫病研究。*通讯作者

S852.618

A

1007-5038(2017)07-0070-04

文献综述