气肿疽梭菌检测方法概述

张 皓，任春宇，车 达，张永佳，李成辉，金 鑫*

(1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.延边州畜牧总站，吉林延吉 133000；3.延边州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133000)

气肿疽梭菌检测方法概述

张 皓1，任春宇2，车 达3，张永佳1，李成辉1，金 鑫1*

(1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.延边州畜牧总站，吉林延吉 133000；3.延边州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133000)

气肿疽(Clostridiumchauvoeiinfection)病原体为气肿疽梭菌，是一种发生于反刍动物的急性、热性、败血性传染病。常见的典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀，触压有捻发音，该病的流行有一定的地方性、季节性，多发生在潮湿的山谷、牧场，且在天气炎热的多雨季节。近几年常有暴发牛气肿疽的报道，给养殖业的发展带来了巨大的冲击和经济损失，同时也逐渐地威胁到畜牧生产和人类的安全。国内关于该病的研究多数为病例报道，对于该病的详细研究和综述却是少之又少，论文参考国内外相关文献，从方法、原理、优缺点等多个方面阐述气肿疽的检测方法，以期为该病的诊断提供参考。

气肿疽梭菌；检测方法；免疫学；分子生物学

气肿疽又称为黑腿病，是由气肿疽梭菌(Clostridiumchauvoei)引起的细菌性传染病[1]。气肿疽梭菌以芽胞状态侵入动物机体内后，在肠腺中的无氧条件下出芽繁殖，通过淋巴组织和血液循环到达组织。病原体在肌肉组织受伤时生长繁殖，并产生毒素，组织局部充血、出血和血浆渗出，并产生硫化氢、含铁血黄素，导致肌肉污黑、发臭，触压有捻发音。随着病情的发展，可引起中枢神经机能障碍病程后期将引发致死性毒血症或菌血症[2]。该病多发生于牛羊等反刍动物[3]，近几年偶尔有人发生感染而死亡的病例，这使得该病迅速成为诸多国家共同关注的焦点和研究热点。根据其流行特点和病理变化等可做出初步诊断，但该病与炭疽、巴氏杆菌病、恶心水肿有相似之处。笔者通过深入分析，列举并阐述该病病原体的几种检测方法，提出该病快速诊断的有效措施。

1 病原学特点

气肿疽梭菌又名肖氏梭菌，梭状芽胞杆菌属，专性厌氧菌。菌体大小约为0.5 μm～1.7 μm ×1.6 μm～9.7 μm，两端钝圆，无荚膜，有周身鞭毛能运动，芽胞位于中央或偏向一端，可在土壤中生存5年之久。气肿疽梭菌的最佳生长温度为37 ℃，最适pH为7.2～7.4。在葡萄糖血琼脂培养基上菌落为圆形、半透明，中心略微隆起的纽扣状菌落，有微弱的β溶血[4-5]。

2 流行病学特点

气肿疽的主要传染源是病牛，病原体来自患病动物的尸体、分泌物或排泄物，在自然界中以芽胞的形式广泛存在于土壤中，当反刍动物采食被污染的饲草或饮水时感染。通常经过消化道黏膜创伤侵入组织引发感染，也可经创伤或蚊虫叮咬感染[6]。6月龄～2岁黄牛最易感，牦牛、山羊次之，实验动物中豚鼠最为敏感[7]。潮湿山谷、沼泽地带、降水量多的地区易使病原体孳生，该病极易暴发，夏秋两季气候温热，降水充足，因此成为该病的高发期。在过去几年的报道中可见该病的流行有一定的地域性、季节性，发病率不高、病死率高，某一地区一旦发病，疫情将会反复发生，并导致牲畜死亡[8]。

3 检测方法

3.1 常规检测

主要根据流行病学特点、临床症状及病理特征做出初步判断。动物感染气肿疽后表现基本相似，呈现急性发病，体温达到41℃～42℃，全身症状明显，肌肉丰满部位发生肿胀，出现跛行，患部皮肤干硬形成坏疽，食欲减退，呼吸困难，常常1 d～3 d内死亡。病畜死后尸体迅速腐败，四肢僵直，天然孔有泡沫样血液流出。肌肉横切面呈黑红色，肌纤维束有小气泡胀裂[9]。剖检可发现口腔黏膜充血，胸腔、腹腔有暗红色渗出液，肠管空虚，肾盂充血有豆粒大小的坏死灶[10-11]。

镜检可见肌肉呈玻璃样病变，胞核溶解消失，肌纤维间存在病原菌，病变中心区域呈变性坏死。染色后镜下可见两端钝圆的大杆菌，呈革兰阳性，芽胞位于菌体中央或偏于一端。菌体多为单个存在，也可见两个相连[12]。

3.2 免疫学检测

3.2.1 间接ELISA 间接ELISA是在保持抗原免疫活性的条件下，将其结合到某种固相载体表面，使被检测疑似患病动物血清和酶标记物反应形成抗原抗体复合物，并加入酶作用的底物，最终通过分析反应结束后有色产物的量确定样品中抗体含量[13]。车达等[14]首次成功构建了气肿疽间接ELISA检测方法，以气肿疽梭菌裂解菌体为抗原，当浓度为50 μg/mL，酶标二抗稀释度为1∶2 000的条件下，成功建立了病原菌的酶联免疫吸附试验。该方法是一种简便的免疫学检测方法，有良好的特异性和重复性。

3.2.2 Dot-ELISA Dot-ELISA是将免疫酶固相载体法的反应板用纤维素膜代替，而形成的一种免疫学检测方法，这种方法弥补了容易包被不牢而造成失败的缺点，且样品需求少，节省材料。该原理与ELISA相似，将抗原吸附在纤维素薄膜上，在保持其免疫活性的前提下，与抗原抗体酶标记物产生免疫反应并形成抗原抗体复合物。该复合物可在酶的参与下显示出色斑，通过色斑的颜色深度即可判定检测结果。姜咏越[15]应用气肿疽标准株纯化抗原免疫动物制备标准血清作为一抗载体膜，建立了检测气肿疽病原体毒素的双抗体夹心Dot-ELISA检测方法。确定了当抗体稀释度为1∶1 024时，可检测到最低菌体抗原量为3.15 μg，最低分泌抗原量为1.89 μg，最适酶标二抗浓度为1∶4 000。该方法较ELISA有更高的特异性和敏感性,可以检测到微量气肿疽梭菌毒素，且抗体用量少、易于保存、操作方便。

3.2.3 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术。任春宇等[16]选用气肿疽梭菌标准株制备菌体单克隆抗体，并将单克隆抗体与胶体金标记结合，成功研制出了能够对气肿疽做出快速诊断的胶体金免疫层析试纸条。该方法与ELISA检测相比有较高的灵敏度和特异性，可检测出最低抗原量为1×105CFU/mL，且有较好的稳定性，保存时间长久。

3.3 分子生物学检测

3.3.1 聚合酶链反应 聚合酶链反应(PCR)是体外模拟核酸复制的过程，对细菌特异性部分进行检查。日本研究者Sasaki Y曾以气肿疽鞭毛基因为目的基因，进行了与其他4种细菌的鉴别检测。德国几位科研人员也应用该PCR成功鉴别出气肿疽梭菌与其他腐败梭菌。云巾宴等首次以气肿疽细胞毒素A为基础，建立了气肿疽的PCR检测方法[17-18]，该方法是检测气肿疽梭菌相对快速高效的方法，适用于临床上气肿疽的诊断。

3.3.2 套式PCR 套式PCR又称巢式PCR，是一种特殊的聚合酶链反应，使用两对引物扩增完整的片段。这种方法的优点在于第1对引物扩增若发生错误，第2对引物将很难配对并扩增，保证了试验的准确性。姜丹丹等[19]以16 S rRNA为基础成功建立了气肿疽梭菌套式PCR检测方法，该方法与传统方法相比操作过程简单，适用于气肿疽的流行病学调查。

3.3.3 二重PCR 二重PCR是以PCR为基础，能够通过一次反应检测多种病原，适用于病原体的鉴别和分离。彭小兵等[20]综合了Sasaki Y等的研究方法，以16 S～23 S rDNA间隔区和23 S rDNA的部分序列作为菌株的识别位点，同时添加了腐败梭菌α毒素基因的特异性引物，最终建立了具有特异、快速且准确的既可以鉴别气肿疽梭菌，又可以鉴别腐败梭菌的二重PCR检测方法。

3.3.4 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(real-time PCR)是在PCR反应体系的基础上加入荧光基团，利用荧光信号的累积同步监测反应进程，再通过标准曲线进行定量分析的方法。Halm A等[21]以16 S rRNA基因序列为模板，建立了气肿疽梭菌的荧光定量PCR检测方法，该方法能够从32个梭菌属和10个非梭菌属中准确地鉴定气肿疽梭菌。Martin L等[22]以spo0A基因为基础，建立了多重实时定量PCR，快速可靠地鉴定了气肿疽梭菌与腐败梭菌等临床样本。2011年Garofolo G等[23]建立了多重实时定量PCR检测方法，以TPI基因序列为模板，设计了特异性引物和探针，也能够鉴别腐败梭菌和气肿疽梭菌。

4 展望

自20世纪以来，气肿疽在国内20多个地区的暴发为我国畜牧业发展带来了严重的经济损失。及时鉴别和迅速诊断对于控制该病的流行和暴发极为重要，需要建立针对该病快速有效的诊断方法，采取有效的预防和治疗方法控制气肿疽的流行和蔓延。随着近年来免疫学和分子生物学等技术的迅速发展，越来越多新型的鉴别诊断方法的出现为该病的防控奠定了基础。

以上检测方法各有优势与局限性，需要针对实际需求、临床操作条件以及实验环境，选择符合条件的病原体检测方法进行疾病诊断，或同时采用免疫学和分子生物学检测方法确保诊断的正确性。

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SummaryofMethodsforDetectionofClostridiumchauvoeiInfection

ZHANG Hao1, REN Chun-yu2, CHE Da3, ZHANG Yong-jia1, LI Cheng-hui1, JIN Xin1

(1.DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,Yanji,Jilin,133000,China;2.AnimalHusbandryStationofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China;3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China)

Clostridiumchauvoeiinfection is an acute,febrile,septic infectious disease in ruminants.The typical symptoms of infected animals are inflammation and emphysematous swelling in muscular rich position.When pressing,there is a crepitus.The epidemic ofClostridiumchauvoeiinfection is regional and seasonal, and it usually occurs in the wet valley ranch or the season which is warm and rainy.Recently,the report showedClostridiumchauvoeiinfection erupted in some area,which brought huge economic losses to the development of animal husbandry,at the same time,Clostridiumchauvoeialso affected human security.Majority researches of the infection inland were descriptionS to the cases.The detailed research or summary of it was less.This article summarized the detection ofClostridiumchauvoeiinfection in methods,principles,advantages and disadvantages based on document literatures at home and abroad for providing beneficial reference to diagnose of the infection.

Clostridiumchauvoei;detection method;immunology;molecular biology

2017-02-27

吉林省教育厅“十二五”科学技术重点项目(612014029)

张 皓(1994-)，女，吉林敦化人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。*

S852.616

:A

:1007-5038(2017)09-0119-03