布鲁菌外膜小泡研究进展

孙春庆，于勇谋，申颖，董 浩

(1.山东省临沂市畜牧局，山东临沂 276000；2.山东省乳山市乳山口镇畜牧兽医工作站，山东乳山 264500；3.山东省畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261000;4.中国动物疫病预防控制中心，北京 102600)

布鲁菌外膜小泡研究进展

孙春庆1，于勇谋2，申颖3，董 浩4*

(1.山东省临沂市畜牧局，山东临沂 276000；2.山东省乳山市乳山口镇畜牧兽医工作站，山东乳山 264500；3.山东省畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261000;4.中国动物疫病预防控制中心，北京 102600)

布鲁菌病(布病)是最严重的人畜共患病之一，布鲁菌可以导致患病动物的流产及人类的马耳他热。外膜小泡是细菌在生长过程中自发释放的一种球形的双层膜结构。在多种细菌中，外膜小泡发挥着运输细菌物质，抵御宿主杀伤作用，参与生物膜形成等多种功能。外膜小泡也可以影响布鲁菌的内化过程，并干扰宿主的细胞因子反应，从而使布鲁菌建立对宿主的感染。除此之外，由于布鲁菌的外膜小泡具有良好的免疫保护力，使其在布病的防控具有重要的应用价值。

布鲁菌；外膜小泡；免疫保护力

多种革兰阴性菌、革兰阳性菌和古细菌均可以在生长过程中自发释放外膜小泡(outer membrane vesicles，OMVs)。OMVs是一种直径为20 nm～250 nm的球形双层膜结构。对革兰阴性菌的OMVs的研究较多，它们通常是从革兰阴性菌的外膜分泌的[1]。在某些情况下，OMVs的直径可以达到10 nm～500 nm，也会出现一些不规则的形状[2]。

OMVs双层膜的内层膜主要成分是磷脂，外层膜主要成分是脂多糖和磷脂，在双层膜的不同位置还混合着大量的外膜蛋白，这些外膜蛋白的组成与细菌外膜很相似[1,3]。在OMVs的内部则包含着来自细菌周质或者细胞质的组分，例如蛋白、RNA/DNA和肽聚糖等[4-5]。OMVs中的蛋白组分会随着细菌处于不同生长周期、不同类型培养基、不同的应激环境而发生改变。

1 细菌外膜小泡简介

1.1 外膜小泡的蛋白组分

与OMVs中的脂类、核酸相比，蛋白组分一直是研究者们非常感兴趣的问题。通过各种蛋白质学方法研究发现，不同细菌中OMVs中鉴定出的蛋白质种类为50种～338种，其中40%～80%被认为是细菌的外膜蛋白[6-7]。这些鉴定出的蛋白可以分为三大类，即外膜基本成分蛋白、OMVs内的特定蛋白和未知蛋白或污染蛋白。

外膜基本成分蛋白主要是细菌外膜中的部分蛋白，如孔道蛋白、黏附素、鞭毛和菌毛蛋白等[5,8]；OMVs内的特定蛋白主要是一些毒素(肠毒性大肠埃希菌的溶细胞素A、霍乱弧菌的霍乱毒素、空肠弯曲菌的细胞膨胀致死毒素等)和一些酶类(蛋白酶和脲酶)[9]；未知蛋白或污染蛋白主要指那些通常不被认为应该存在于OMVs中的蛋白，随着分离技术的提高，这类蛋白的数量正在逐渐减少。

1.2 外膜小泡的功能

细菌OMVs的功能目前有几类假说，其中一种可信度较高的假说是OMVs作为细菌的一种远距离运输某些特殊组分的传送系统，保护被运送的组分免受稀释与降解[10]。这些被OMVs运送组分的功能可能是帮助细菌获取营养或者营造一个适于生存的宿主内环境。最新的研究表明，牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体可以利用OMVs向宿主细胞内运输msRNAs[11]，而苛养木杆菌则可以利用OMVs转运抗毒素蛋白[12]。OMVs还可能作为一种诱饵与抗体等杀菌组分结合，从而减少宿主对细菌的杀伤作用。在一些细菌中，还发现OMVs参与到生物膜的形成过程，从而使细菌可以在宿主或者土壤环境中生存[12]。有报道还表明由于OMVs可以降低庆大霉素等抗生素的杀菌作用，OMVs可能还与细菌的耐药性相关[13]。除此之外，OMVs还参与到保护细菌抵御噬菌体的杀伤作用和在细菌间转运核酸(质粒DNA、基因组DNA片段或者噬菌体DNA)等生物过程[11,14]。

1.3 外膜小泡的形成

细菌OMVs的形成过程可以描述为通过细菌外膜形成OMVs膜结构的一个出芽过程[15]。目前，细菌OMVs的形成还没有一个通用的机制，但是这个过程通常包括以下几个事件：①细菌外膜和肽聚糖层连接的断开；②细胞质组分的积累；③特定信号或效应因子的活化。

1.4 诱导外膜小泡形成的信号

诱导OMVs形成的信号通常与细菌受到的应激环境密切相关，如温度应激、氨基酸缺乏应激、抗生素及噬菌体的吸附等[16]。除此之外，一些有机分子与细菌OMVs的产生也密切相关，如十六烷可以诱导不动杆菌OMVs产生，葡萄糖可促进耶尔森菌OMVs的分泌，碳酸钠可以诱导霍乱弧菌OMVs的形成[17-19]。

细菌OMVs的产生也与细菌生长周期存在一定的联系。脑膜炎奈瑟菌和土拉杆菌在在生长周期的晚期产生更多的OMVs，而鼠伤寒沙门菌和包柔螺旋体主要在对数生长期分泌OMVs。嗜肺军团菌则是在细胞内和细胞外的任何生长周期均可以产生OMVs[9]。总的来说，在革兰阴性菌的各个生长阶段，OMVs是持续产生的，但是在出现某些特定的信号时，OMVs的产生水平会增强。

2 布鲁菌外膜小泡的研究进展

2.1 布鲁菌外膜小泡的发现

1987年，Gamazo C等[20]在研究布鲁菌的外膜时发现在对数生长期的羊种布鲁菌和粗糙型的羊种布鲁菌突变株均可以自发的分泌含有布鲁菌外膜组分而不含有内膜组分的膜类物质，这种膜类物质就是OMVs。对这些OMVs成分的初步研究表明，其中含有脂多糖、磷脂和多种外膜蛋白，但不含有细菌内膜的标志分子。通过超速离心发现羊种布鲁菌16 M可以产生2种沉降系数不同的OMVs，经过电子显微镜的观察表明2种OMVs的膜结构和大小均不相同。

2.2 布鲁菌外膜小泡的成分

Gamazo C等[21]通过SDS-PAGE对羊种布鲁菌和绵羊附睾种布鲁菌OMVs的蛋白组分进行了研究，发现2种布鲁菌的OMVs蛋白成分非常相似，都由4组蛋白组成(A组：25.5 ku～32.0 ku；B组:21.5 ku～22.5 ku；C组：18.0 ku～19.5 ku；D组：13.0 ku～15.5 ku)。Boigegrain R A等发现猪种布鲁菌在中性培养基和pH 4.0的酸性培养基中均可以自发形成OMVs，而且OMVs中含有丰富的OMP25和OMP31蛋白。通过电子显微镜对猪种布鲁菌的OMVs进行观察，其直径在大约80 nm。

Avila-Calder′on E D等[22]分离了羊种布鲁菌16 M的OMVs并对其蛋白质成分进行了分析，共发现了29个蛋白。这29个蛋白中52%属于细菌外膜，17%来自细菌的周质，20.6%来自细胞质，2个蛋白来自内膜，还有1个蛋白可能属于胞外蛋白。从功能上分类，这些蛋白分别属于:①结构和转运蛋白;②抗原蛋白;③参与代谢过程的蛋白;④参与应激反应的蛋白;⑤侵袭蛋白。

2.3 布鲁菌外膜小泡与宿主免疫

研究发现，多种革兰阴性菌分泌的OMVs具有调理宿主免疫从而利于建立感染的功能[23]。Pollak C N等[24]对牛种布鲁菌OMVs感染人上皮细胞和单核细胞过程中所发挥的功能进行了研究，表明布鲁菌OMVs可以被两种细胞内化，而这一过程与网格蛋白介导的内吞作用存在着一定的关联。用布鲁菌OMVs对THP-1细胞进行预处理，会抑制一些细胞因子正常功能的发挥，如针对大肠埃希菌的脂多糖和鞭毛蛋白，以及布鲁菌的细胞因子反应明显被抑制，而OMVs也会抑制布鲁菌感染过程中THP-1细胞的一些细胞因子反应。用OMVs处理过的THP-1细胞，INF-γ诱导MHCⅡ类分子的水平显著降低。除此之外，用OMVs预处理THP-1细胞后，细胞吸附和内化牛种布鲁菌的数量显著增加。

Avila-Calder′on E D等[22]发现用羊种布鲁菌16 M和一个16 M衍生的粗糙型菌株VTRM1的OMVs刺激骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDC),光滑型布鲁菌分泌的OMVs和粗糙型布鲁菌分泌的OMVs对BMDC中各种细胞因子的影响并不相同，其中粗糙型布鲁菌的OMVs显著上调BMDC中编码IL-12、TNF-ɑ、INF-γ 3种细胞因子基因的表达水平。

2.4 布鲁菌外膜小泡的应用

Avila-Calder′on E D等[22]检测了羊种布鲁菌16 M和粗糙型菌株VTRM1的OMVs对小鼠的免疫保护力。结果显示，Rev1疫苗株免疫的小鼠攻毒后，脾脏菌落数与对照组相比降低了2.64个对数级，16 M的OMVs免疫小鼠攻毒后降低了1.9个对数级，而VTRM1的OMVs免疫小鼠后降低了3.08个对数级。说明粗糙型布鲁菌的OMVs可以对小鼠产生良好的免疫保护力。进一步的研究表明，使用聚醚P85作为OMVs的佐剂免疫小鼠时，可以有效的抵御羊种布鲁菌的感染。这种免疫方法可以增强巨噬细胞TNF-α的分泌水平，使宿主产生更高滴度的IgG，而IFN-γ和IL-4等细胞因子的表达水平并不发生显著改变[25]。Kaur G等[26]对牛种布鲁菌的OMVs也开展了相关研究，其发现牛种布鲁菌99株分离的OMVs，具有良好的免疫原性，免疫动物可以产生针对OMVs的特异性的、高滴度的免疫反应。

3 展望

布鲁菌作为一种胞内寄生菌，其在宿主细胞内生存和免疫逃逸的机制一直是研究的热点。由于布鲁菌的OMVs在分泌细菌蛋白、调理宿主免疫和建立感染过程中发挥着重要作用，对布鲁菌OMVs的研究无疑对阐明布鲁菌致病机制和宿主与布鲁菌相互作用都具有重要意义。

鉴于布鲁菌病对公共卫生和经济发展的严重影响，各国对净化、根除布鲁菌病的要求也愈来愈迫切。目前，国际上使用的布鲁菌疫苗基本都是弱毒活疫苗，这类疫苗对怀孕动物和人类具有一定的感染性。布鲁菌OMVs本身并不具有感染性，还具有良好的保护力，无疑是布鲁菌新型亚单位疫苗的一个极佳选择。

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Abstract:Bacteria of the genusBrucellaare responsible for one of the world’s most widespread zoonotic infections,causing infectious abortion in animals and a febrile disease,known as Malta Fever,in haman.Outer membrane vesicles are spherical bi-layered membrane structures，which are released spontaneously during growth by many bacteria.In various bacteria,outer membrane vesicles play important roles in delivering components,resistance to host immune response and formation of biofilms.Outer membrane vesicles affect the internalization process ofBrucellastrains and the cytokine response of the hosts,so thatBrucellaspp.could survive in the hosts.In addition,as outer membrane vesicles ofBrucellahave good immunoprotection,they have important value in the prevention and control of brucellosis.

Keywords:Brucella; outer membrane vesicle; immunoprotection

ProgressonOuterMembraneVesiclesinBrucella

SUN Chun-qing1,YU Yong-mou2,SHEN Ying3，DONG Hao4

(1.AnimalHusbandryBureauofLinyiCity,Linyi,Shandong,276000,China; 2.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofRushankou,Rushan,Shandong,264500,China; 3.ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Weifang,Shandong, 261000,China; 4.ChinaAnimalDiseaseControlCenter，Beijing，102600,China)

S852.614

A

1007-5038(2017)08-0089-04

2016-12-03

国家自然科学基金项目(31602055)

孙春庆(1982-)，男，山东烟台人，学士，主要从事动物疫病防控研究。*