中式纳豆制备技术的研究

严美婷，杜霞，邱醒，张超凤，李海闽，吴国平，陈卫平*

(江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

中式纳豆制备技术的研究

严美婷，杜霞，邱醒，张超凤，李海闽，吴国平，陈卫平*

(江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

为探索出符合中国人口味且纳豆激酶酶活力高的中式纳豆加工技术，该研究从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto），并筛选出一株产纳豆激酶能力最强的菌株NK3。以牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆菌种，通过单因素试验考察发酵温度、时间、接种量、加水量对纳豆激酶酶活力的影响，采用正交试验优化纳豆发酵条件。结果表明，以牛奶为培养基培养的纳豆菌生长良好，在发酵温度27℃、发酵时间1.5 d、接种量5%、加水量6%条件下，菌株NK3发酵制备出的纳豆无氨臭味，有淡淡的奶香味，且纳豆激酶酶活力高达668.5 U/g。

纳豆；纳豆芽孢杆菌；纳豆激酶；牛奶培养基

纳豆是一种在日本具有2 000多年悠久历史的营养食品，它是将大豆煮熟后，接种纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵后而形成的发酵型食品[1-3]。纳豆芽孢杆菌在发酵过程中会产生纳豆激酶，此酶具有较强的纤溶活性，能有效预防和治疗心脑血管疾病[4]。

近年来，随着我国居民生活水平的日益提高，心脑血管疾病的患者人数也日益增多，虽然市面上现有许多治疗心脑血管疾病的药品，但其副作用大[5]。有研究表明，因纳豆中含有纳豆激酶，长期食用纳豆能有效预防和治疗心脑血管疾病，而且还有助消化、抗癌、抗氧化和延缓衰老以及壮体强身、护肝美容、预防感冒和防止醉酒等功效[6-9]。因此，探究纳豆的发酵工艺，以提高纳豆中纳豆激酶的活力，改善纳豆的口感风味，从而提高纳豆的营养和保健功能，有着非常广泛的发展前景。并且目前我国的大豆生产加工存在附加值低的现象，因而将大豆进一步深加工发酵纳豆，符合农业产业化及高附加值要求[10]。目前国内纳豆生产多采用日本纳豆的发酵工艺，一般用传统的种子液培养基（即牛肉膏蛋白胨液体培养基）扩大培养纳豆芽孢杆菌菌种，在37～40℃条件下短时间发酵生产纳豆[10]。然而采用上述条件制备出的纳豆会产生很难闻的发酵氨味，较难被大多数中国人所接受，且纳豆激酶的活力也不高。如今，符合中国人口味的中式纳豆（即无发酵氨臭味）的制备技术研究较少。

本研究通过从市售的4种纳豆中分离筛选出一株产纳豆激酶酶活力较强的菌株，通过用牛奶培养基替代传统的种子液培养基扩大培养纳豆菌，并对其固态发酵产纳豆激酶的条件进行优化，拟寻找出一条最佳的、符合中国人口味的中式纳豆发酵工艺条件。以期改善纳豆菌固态发酵纳豆的气味，生产出无氨臭味、口感风味良好、纳豆激酶酶活力高的中式纳豆。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和原料

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）NK1、NK2、NK3、NK4：分别从市售的燕京纳豆、大连美屋纳豆、日本鹤子一番纳豆、日本道后纳豆中分离纯化而来。

脱脂乳粉（蛋白质含量为32.6%）、黄豆：市售。

1.1.2 试剂

牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉（生化试剂）、福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、碳酸钠、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；酪蛋白（分析纯）：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.1.3 培养基

斜面活化培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，琼脂1.8%，pH 7.0～7.4，121℃、0.1 MPa灭菌20 min。

种子液培养基：葡萄糖1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾0.4%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0～7.4，121℃、0.1 MPa灭菌20 min。

基础牛奶培养基[11]：脱脂乳粉12%，葡萄糖0.5%，pH 7.0～7.4，112℃、0.07 MPa灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

AR2140电子分析天平：奥豪斯有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；NSKY-2102C恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；T22型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；MJ-54A高压灭菌锅：施都凯仪器设备有限公司；DH3600电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌优选

从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌[4]，分别编号为NK1、NK2、NK3、NK4。将这4株活化好的纳豆芽孢杆菌分别接入种子液培养基中，置于摇床上35℃、140 r/min振荡培养18 h制成种子液。然后在无菌条件下，以5%的接种量将种子液接入已蒸煮灭菌的黄豆中，并加入7%的无菌水均匀搅拌，置于32℃恒温箱中发酵2 d制成纳豆[12]。采用福林酚法测定纳豆中的纳豆激酶酶活[13-15]，每组试验做3个重复，筛选出产酶活最高的菌株。

1.3.2 牛奶种子培养基的选择

将基础牛奶培养基中的脱脂乳粉含量设置为8%、10%、12%、14%、16%，然后将优势菌株NK3菌分别接入牛奶培养基（装液量为50 mL/250 mL）及传统的种子液培养基（对照组）中进行扩大培养。每组试验做3个重复，采用稀释平板涂布法计数[16]，以活菌数为指标，考察牛奶培养基中脱脂乳粉含量对纳豆菌NK3生长的影响，并对比该菌在牛奶培养基与传统的种子液培养基中生长的情况。

1.3.3 单因素试验优化

将菌株NK3种子液均匀地拌入已蒸煮灭菌的黄豆中，在一定的发酵条件下进行纳豆发酵，分别考察发酵温度（24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃）、接种量（以黄豆湿质量计）（3%、4%、5%、6%、7%）、加水量（以黄豆湿质量计）（3%、5%、7%、9%、11%）、发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）对纳豆中纳豆激酶酶活的影响。每组试验做3个重复，测定成品纳豆中纳豆激酶酶活，以确定最适的发酵条件。

1.3.4 正交优化试验

根据单因素试验的结果，选取发酵温度（A）、接种量（B）、加水量（C）、发酵时间（D）为因素，以纳豆激酶酶活为考察指标，进行正交优化试验。正交试验因素与水平见表1。

表1 纳豆发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for natto fermentation conditions optimization

为考察本研究纳豆发酵条件的优化效果，分别采用优化前后纳豆发酵工艺发酵制备纳豆，比较优化前后纳豆的感官品质及纳豆激酶酶活，并与4种市售纳豆（燕京纳豆、大连美屋纳豆、日本鹤子一番纳豆、日本道后纳豆）进行对比。感官评分满分为100分，感官评价标准见表2。

表2 纳豆感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of natto

2 结果与分析

2.1 高产纳豆激酶纳豆芽孢杆菌的优选

将4株纳豆芽孢杆菌种子液接种至已蒸煮灭菌的黄豆中制备纳豆，测定纳豆中的纳豆激酶酶活，测定结果见图1。

由图1可知，纳豆芽孢杆菌NK4发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活最低，而由菌株NK3发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活最高，为497.1 U/g，且经测定4株菌株分别所对应的原始样品纳豆（燕京纳豆、大连美屋纳豆、日本鹤子一番纳豆、日本道后纳豆）中的纳豆激酶酶活分别为369.4 U/g、451.8 U/g、460.5 U/g、322.7 U/g，均比菌株NK3发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活低，因此说明菌株NK3的发酵性能好。故在后续试验中将选取纳豆芽孢杆菌NK3作为纳豆发酵的发酵菌株。

图1 不同菌株对纳豆激酶酶活的影响Fig.1 Effect of different strains on nattokinase activity

2.2 牛奶种子培养基的选择

将优势菌株NK3接入牛奶培养基，考察牛奶培养基中脱脂乳粉含量对菌株NK3活菌数的影响，结果见图2。

图2 培养基中脱脂乳粉含量对菌株生长的影响Fig.2 Effect of skimmed milk powder content in culture medium on the strains growth

由图2可知，随着牛奶培养基中脱脂乳粉含量的增加，种子液中纳豆芽孢杆菌的活菌数呈现先增加后减少的趋势。当脱脂乳粉含量为14%时，各营养物质丰富，菌体生长旺盛，大量繁殖，活菌数达到了8.2×109CFU/mL，而对照组中的活菌数为1.5×109CFU/mL。表明纳豆芽孢杆菌在脱脂乳粉含量为14%的牛奶培养基中生长良好，因此可以用含14%脱脂乳粉的牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养菌种。

2.3 单因素试验发酵条件的优化

2.3.1 发酵温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

选用不同的发酵温度对纳豆芽孢杆菌NK3进行发酵，其纳豆中纳豆激酶酶活检测结果见图3。

由图3可知，随着发酵温度的升高，纳豆激酶酶活先上升后下降，其中在39℃条件下发酵的纳豆中纳豆激酶酶活最低，可能是由于温度较高，纳豆芽孢杆菌生长代谢旺盛，代谢产物积累过多，从而使纳豆激酶酶活降低。而在27℃条件下温度适宜，发酵的纳豆激酶的酶活最高，达到了525.6 U/g。因此，最佳的发酵温度应为27℃。

图3 发酵温度对纳豆激酶酶活的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.3.2 接种量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

选用不同的接种量对纳豆芽孢杆菌NK3进行发酵，其纳豆中纳豆激酶酶活检测结果见图4。

图4 接种量对纳豆激酶酶活的影响Fig.4 Effect of inoculum on nattokinase activity

由图4可知，随着接种量的增加，纳豆激酶酶活呈现先增多后减少的趋势。可能原因是当接种量太低时，纳豆芽孢杆菌过少，延长菌体延迟期，使纳豆发酵不充足，导致酶活较低；而接种量过高时，菌体密度大，纳豆菌生长过快，衰老细胞增加，发酵后劲不足，影响了纳豆激酶的合成。当接种量为5%时，发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活最高，达到515.1 U/g。因此，选择接种量5%为宜。

2.3.3 加水量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

选用不同的加水量对纳豆芽孢杆菌NK3进行发酵，其纳豆中纳豆激酶酶活检测结果见图5。

由图5可知，随着加水量的增加，纳豆激酶酶活呈现先增加后减小的趋势。当加水量为7%时发酵的纳豆激酶酶活最高，高达510.6 U/g；在加水量＜7%时，发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活比较低，可能是由于含水量较低时大豆吸水不充分，初期出现了小黄豆干瘪的情况，水分供应不足，纳豆比较松散，拉丝物质少黏性差，各部分的营养物质传递不均匀[17]，限制纳豆菌的生长，从而呈现纳豆激酶酶活随着加水量的增加而增大的趋势；而当加水量＞7%时酶活开始下降，可能是由于当含水量较高时，氧气供应不充足，影响纳豆菌的生长，从而使表面和底部发酵不均匀，导致纳豆激酶酶活偏低。因此，选择加水量7%为宜。

图5 加水量对纳豆激酶酶活的影响Fig.5 Effect of water addition on nattokinase activity

2.3.4 发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

选用不同的发酵时间对纳豆芽孢杆菌NK3进行发酵，其纳豆中纳豆激酶酶活检测结果见图6。

图6 发酵时间对纳豆激酶酶活的影响Fig.6 Effect of fermentation time on nattokinase activity

由图6可知，发酵时间为1 d时，由于发酵不够完全，纳豆激酶酶活较低；培养时间为2 d时发酵的纳豆激酶酶活达到最高，为516.1 U/g；再延长发酵时间会降低纳豆激酶酶活，可能是由于发酵时间太长，代谢产物积累，导致酶活降低。因此，选择发酵时间2 d为宜。

2.4 正交优化试验结果

用DPS v6.55版统计软件对正交试验所得数据进行分析处理，正交试验结果见表3，方差分析见表4。

由表3极差分析结果可知，RA＞RD＞RB＞RC，即各因素对试验指标影响大小为A＞D＞B＞C，通过直观分析得到较佳方案为A2B2C1D1。由表4方差分析表可知，发酵温度对纳豆激酶酶活的影响极显著（P＜0.01），发酵时间对纳豆激酶酶活的影响显著（P＞0.05），而接种量、加水量对纳豆激酶酶活的影响不显著。因此综合极差分析和方差分析结果可得出最优方案为A2B2C1D1。由于在上述正交试验中的9个试验组中没有出现该最佳组合，因此需要进行验证试验。

采用组合A2B2C1D1发酵后纳豆中纳豆激酶酶活达668.5 U/g，因此最佳发酵条件发酵温度为27℃、接种量5%、加水量6%、发酵时间1.5 d。

表3 纳豆发酵条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for natto fermentation optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5 纳豆发酵对比试验

采用优化前后纳豆发酵工艺技术发酵制备纳豆，检测纳豆的感官品质及纳豆激酶酶活，并与4种市售纳豆进行对比，其检测结果见表5。

表5 纳豆发酵对比试验结果Table 5 Result of natto fermentation comparison experiments

由表5可知，经优化后发酵的纳豆感官品质优质，纳豆激酶酶活高达668.5 U/g，比优化前及市售的4种纳豆中的纳豆激酶酶活均高。并且对优化后发酵的纳豆进行感官品评发现纳豆无氨味，无后苦味，并且带有淡淡的奶香味，这可能与用牛奶培养基培养菌种有关。发酵的纳豆感官品质比目前市售的纳豆均好，更符合国内消费者的口味。

3 结论

本研究从市售的4种纳豆中分离筛选出一株产纳豆激酶能力较强的菌株NK3，此菌株发酵的纳豆激酶酶活均高于市售的4种纳豆，且该菌株在含14%脱脂乳粉的牛奶培养基中生长良好，故采用含14%脱脂乳粉的牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆芽孢杆菌NK3。通过单因素及正交试验优化纳豆的发酵工艺，得出了最佳的纳豆制备工艺条件为发酵温度为27℃，发酵时间为1.5 d，接种量为5%，加水量为6%。在此条件下发酵出的纳豆中的纳豆激酶酶活达668.5 U/g，远高于优化前（485.0 U/g）的酶活，且纳豆的感官品质优良，无不良气味与口感，带有淡淡的奶香味，符合国内大多数消费者的口味，是更易被中国人所接受的中式纳豆。为中式纳豆发酵工艺的研究提供了理论基础。

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Research of Chinese natto preparation technology

YAN Meiting,DU Xia,QIU Xing,ZHANG Chaofeng,LI Haimin,WU Guoping,CHEN Weiping*
(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In order to explore process technology of Chinese natto which was conform to Chinese people taste and had high nattokinase activity,the fourBacillus nattowere isolated from four kinds of commercial natto.A high nattokinase-producing strain NK3was obtained,and theB.nattowas cultured using the milk culture medium to replace the traditional seed liquid culture medium.The effects of fermentation temperature,time,inoculum and water addition on nattokinase activity were investigated by single factor experiment.The natto fermentation conditions were optimized by orthogonal experiments.The results showed that theB.nattogrew well in the milk culture medium.Under the conditions of fermentation temperature 27℃,time 1.5 d,inoculum 5%and water addition 6%,the natto fermented by strain NK3had no ammonia smell with light milk fragrance,and the nattokinase activity reached 668.5 U/g.

natto;Bacillus natto;nattokinase;milk culture medium

TQ920.1

0254-5071（2017）02-0175-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.038

2016-09-06

国家自然科学基金项目（31560480）

严美婷（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：陈卫平（1958-），男，教授，博士，研究方向为食品微生物。