高效液相色谱法测定磺胺间甲氧嘧啶的含量

陈锡龙(贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550003)

高效液相色谱法测定磺胺间甲氧嘧啶的含量

陈锡龙
(贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550003)

建立了兽药磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中磺胺间甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法。以C18为固定相，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)为流动相，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长270 nm，采用外标法进行定量。磺胺间甲氧嘧啶的线性范围为5.0～100.0 μg/mL，回归方程为Area=40.333×Amt-18.843 (n=5)，相关系数大于0.999。从高(120%)、中(100%)和低(80%)三个添加水平的检测结果可以看出，磺胺间甲氧嘧啶的回收率为96.27%～98.30%。该方法简单，准确，精密度好，回收率高，可以用于测量磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中磺胺间甲氧嘧啶的含量。

磺胺间甲氧嘧啶；含量；高效液相色谱法

目前，兽用药品磺胺间甲氧嘧啶(C11H12N4O3)(钠)的含量测定采用永停滴定法[1-2],相对于高效液相色谱法，永停滴定法较繁琐、耗时，且不利于及时发现药品中的其他非法添加成分。采用高效液相色谱法测定兽药含量是检测技术发展的未来趋势，也是提高检测效率的必然要求。本研究建立了磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中磺胺间甲氧嘧啶钠(以磺胺间甲氧嘧啶计)含量的高效液相色谱测定法，并根据《兽药质量标准分析方法验证指导原则》对新建立方法的准确度、重复性、精密度、专属性、耐用性及线性等进行了研究。

1 材料和方法

1.1 仪器和试药 Agilent 1260 infinity 高效液相色谱仪(配紫外检测器)；BP211D型电子分析天平(德国塞多利斯公司)；超声波清洗器(KQ-300DE,昆山市超声仪器厂)；磺胺间甲氧嘧啶对照品(中国兽医药品监察所,批号：C0031007，含量：99.4%)；磺胺间甲氧嘧啶钠注射液分别由四川维尔康动物药业有限公司、成都博大金点生物技术有限公司和四川好益多动物保健品有限公司提供(批号分别为：20150601，20151218，20160201；标示含量为：10 mL:1 g、10 mL:1 g和10mL：0.5g)；乙腈为色谱纯；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Zorbax SB C18(5 μm， 4.6 mm×250 mm)；柱温为40 ℃；流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)；流速1.0 mL/min；检测波长270 nm；进样体积10 μL。在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1、图2。

图1 磺胺间甲氧嘧啶对照品溶液色谱图(100 μg/mL)

图2 磺胺间甲氧嘧啶钠注射液供试样品溶液色谱图(100 μg/mL)

1.2.2 对照品溶液的制备 准确称取磺胺间甲氧嘧啶对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加盐酸1 mL溶解后，再加水稀释至刻度，混匀，即得浓度为1.0 mg/mL的磺胺间甲氧嘧啶对照品贮备液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺间甲氧嘧啶对照品贮备液10 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得100 μg/mL的磺胺间甲氧嘧啶对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取磺胺间甲氧嘧啶钠注射液适量，置于100 mL容量瓶中，加2 mL盐酸溶解后，再加水稀释至刻度，混匀。然后，按标示量稀释制成100 μg/mL的溶液。

2 结果与分析

2.1 线性范围 精密量取1.0 mg/mL的磺胺间甲氧嘧啶对照品贮备液0.5、1、2、5、10 mL，分别置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得含磺胺间甲氧嘧啶浓度分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的对照溶液系列。精密吸取各对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别进样两针。磺胺间甲氧嘧啶浓度在5.0～100.0 μg/mL范围内，色谱峰有良好的线性关系，回归方程为Area=40.333×Amt-18.843，相关系数大于0.999，标准曲线数据见表1。

表1 磺胺间甲氧嘧啶对照品溶液的标准曲线数据表

2.2 精密度 取C公司提供的批号为20151218的磺胺间甲氧嘧啶钠注射液，精密量取1000 μL,置100 mL容量瓶中，按1.2.3项制备成供试品溶液，分别作6个平行，每个样品进样1针，进行含量测定。以测定结果峰面积的相对标准偏差表示试验的精密度，精密度RSD为1.10%，表明方法的精密度良好(表2)。

表2 精密度及含量测量结果

2.3 准确度 精密量取批号为20150601的磺胺间甲氧嘧啶钠注射液500 μL，按高(120%)、中(100%)和低(80%)三个浓度水平分别添加磺胺间甲氧嘧啶标准品，制得向已知含量制剂中添加已知测定物的添加样品，每个浓度水平的添加样品分别制备3份供试样。按1.2.3项制成供试品溶液，进行含量测定。以磺胺间甲氧嘧啶的实际测定含量和理论含量(制剂中磺胺间甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值计算磺胺间甲氧嘧啶的回收率，结果见表3。结果表明，三个不同添加水平的磺胺间甲氧嘧啶的回收率均在96.27%～98.30%之间，方法符合《兽药质量标准分析方法验证指导原则》。

表3 准确度测量结果

回收率R(%)=实测平均含量/理论含量×100%

2.4 耐用性 取按准确度测定项下制得的样品，保持流动相比例和流速不变，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity 色谱仪上分别使用Phenomenex Luna C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)和Zorbax SB C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)色谱柱于40 ℃条件下进行测试，考察方法的耐用性，结果表明,使用不同的仪器和色谱柱在相同的实验条件下测得的含量的相对偏差不大于0.5%，耐用性良好。

2.5 专属性 在磺胺间甲氧嘧啶钠注射液样品测试色谱图中，标准出峰时间附近均未发现明显的干扰峰，可见方法的专属性良好。

2.6 稳定性 取100 μg/mL的磺胺间甲氧嘧啶对照品溶液分别于约0、24、48 h测定含量，以峰面积计算相对标准偏差，磺胺间甲氧嘧啶的RSD为0.38%，说明磺胺间甲氧嘧啶溶液在48 h内稳定。

2.7 含量测定 取批号为20150601、20151228和20160201的三批企业样品，分别测定磺胺间甲氧嘧啶钠的含量，按以上方法测定计算，结果表明该3批样品的平均含量分别为标示含量的101.6%、96.3%和101.8%，而使用现行兽药典方法测得的结果分别为102.4%、97.8%和103.4%。

3 讨论与小结

3.1 色谱条件及检测波长的选择 当前文献报道测量磺胺类药物的高效液相色谱法所使用的流动相系统有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)[1]、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)[3]、0.017 mol/L磷酸-乙腈(80+20)[4]、磷酸盐溶液-甲醇(65+35)[5]等，柱温主要有30 ℃、40 ℃，检测波长多为270 nm[6-7]、230 nm[1, 8]。在200～400 nm波长范围内对磺胺间甲氧嘧啶对照品溶液进行波长扫描，磺胺间甲氧嘧啶最大吸收峰为295、250、230 nm，在285、270、215 nm处均有较强吸收峰。为尽量保持磺胺类药物液相色谱检测方法的一致性，同时也能够获得较好的分离效果，选择270 nm作为检测波长，40 ℃作为色谱柱柱温，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)作为流动相。使用此色谱条件进行检测，磺胺间甲氧嘧啶的出峰时间适当，峰形良好。

3.2 样品提取方法的优化 在进行样品处理的过程中，分别采用1 mL、3 mL盐酸，1 mL、3 mL 20 g/L NaOH溶液，少量乙腈等溶解样品，然后再加水定容。发现采用1 mL盐酸溶解处理样品后峰形最佳且测量的偏差最小，故选择使用1 mL的盐酸溶解处理样品后再加水定容。磺胺间甲氧嘧啶钠注射液加入盐酸处理时首先会产生白色沉淀，盐酸过量后白色沉淀会重新溶解。

本研究建立了磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中磺胺间甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法是可行的，各项方法学指标均比较理想，可以作为磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中磺胺间甲氧嘧啶质量控制标准。

[1] 中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典(二部)[M]．二O一O年版. 北京：中国农业出版社.[2] 农业部兽药评审中心,兽药国家标准汇编——兽药地方标准上升国家标准(第一册)[M].北京：中国农业出版社.2010：87-90

[3] 中国兽医药品监察所.中国兽医药品监察所兽药残留检验操作规程CJCZ020[Z]．

[4] 中华人民共和国农业部.农牧发[2001]38号文件[S].

[5] 耿士伟，曲斌，姜加华，等．QuEChERS-UPLC-MS/MS快速测定鸡肝中七种磺胺类药物残留[J]. 中国兽药杂志, 2011, 45(10) : 16-19.

[6] 查玉兵，陈美，王晓芳，等．高效液相色谱法测定猪肉中五种磺胺类药物残留量[J]. 分析仪器，2008，(4): 44-45.

[7] 陈锡龙. HPLC法测定复方磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的含量[J].中国兽药杂志, 2014, 48(7):30-33.

[8] 杨武宁，崔艳莉. HPLC法测定复方磺胺对甲氧嘧啶钠可溶性粉含量[J].中国动物保健, 2013, 15(8): 30-32.

(编辑：侯向辉)

Determination of Sulfamonomethoxine by HPLC

CHEN Xi-long
(GuizhouProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeeds,Guiyang550003,China)

An HPLC method has been developed to determine the content of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection, using C18 column as stationary phase, with a mobile phase of 0.1% phosphoric solution-acetonitrile (80∶20) and wavelength of 270 nm. It was quantified by external standard method and the linear range of sulfamonomethoxine was between 5.0 and 100.0 μg/mL. And the regression equation wasArea=40.333×Amt-18.843 (n=5) with the correlation to be more than 0.999. The average recoveries at three different levels of 120%, 100% and 80% of the sample ranged between 96.27% and 98.30%. This method was simple and accurate, and had a good precision and high recoveries as well, could be used for determination of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection.

sulfamonomethoxine; content; HPLC

陈锡龙, 高级兽医师，从事兽药质量检验检测及相关研究。E-mail: cxlofyjs@163.com

2016-10-08

A

1002-1280 (2017) 02-0016-04

S859.2