乳酸菌发酵鱼下脚料的培养基优化

郑毅+梅益生+章新

摘 要：隨着我国水产加工业的进一步发展，势必会产生大量的水产下脚料，通过益生菌发酵生产微生物菌肥，是实现下脚料高质化应用的重要方向。该研究通过试验优化鱼下脚料培养基的组分，经单因素及正交实验确定乳酸菌发酵鱼下脚料的培养基为：鱼下脚料300g/L、红糖100g/L、K2HPO4 2g/L和CaCO315g/L。

关键词：乳酸菌；鱼下脚料；发酵培养基；优化

中图分类号 TS254.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）04-0017-03

我国的水产加工品占水产总量仅为30.7%[1]，远低于发达国家的70%[2]。随着水产加工业的进一步发展，势必会产生了越来越多的水产下脚料，这些水产下脚料富含蛋白质、不饱和脂肪酸等营养物质[3]，如果不进行恰当的处理，不仅会造成资源的浪费，而且会引发严重的环境污染。近年来，以益生菌发酵技术处理水产下脚料以达到综合利用的目标，如国外已有利用乳酸菌发酵加工对虾废弃物方面的研究[4-5]。利用乳酸菌发酵回收虾加工废弃物中的蛋白质[6]，不仅提高了蛋白质的提取率，而且有效去除了产品中的苦涩味和腥臭味，同时发酵后处理简单，易于实现工业化生产。曾少葵等用乳酸菌对罗非鱼酶解液进行发酵[7]，表明乳酸发酵能有效减弱酶解液的腥味，同时发酵后增加的酯类、辛酸及十六醛等物质能明显改善酶解液的风味。本研究在优选乳酸菌的基础上，以鱼下脚料为主要原料，进行糖、无机盐、磷源的培养基组分优化，以期提升乳酸菌发酵水平（菌数），实现高效生物转化。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 鱼下脚料制备 从水产市场购得廉价小杂鱼，加适量水（固液比1∶2），组织捣碎机捣碎制成。

1.1.2 菌种 优选乳酸菌MS，本实验室保藏。

1.1.3 培养基 （1）MRS培养基（%）：牛肉膏1，蛋白胨1，酵母膏0.5，葡萄糖2，吐温80 0.1，磷酸氢二钾0.2，醋酸钠0.5，柠檬酸钠0.5，柠檬酸二铵0.2，硫酸镁0.058，硫酸锰0.025，琼脂1.5～2，pH6.2～6.6，121℃、灭菌20min[5]。（2）初始设计鱼下脚料发酵培养基（%）：下脚料20，红糖2，磷酸氢二钾0.2，碳酸钙1。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液的制备 由活化的乳酸菌斜面接一环至MRS液体培养基，37℃，50r/min，24h，制成乳酸菌种子液。

1.2.2 培养基单因素成分优化

1.2.2.1 下脚料浓度的优化 分别把下脚料培养基配制成150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、400g/L浓度的鱼下脚料的培养基，其他条件不变，发酵48h后稀释涂布，计算菌体数量，确定最佳的下脚料浓度。

1.2.2.2 红糖浓度的优化 分别在培养基中加入10g/L、20g/L、30g/L、50g/L、80g/L浓度的红糖，其他条件不变，发酵48h后稀释涂布，计算菌体数量，确定最适合乳酸菌生长的红糖浓度。

1.2.2.3 磷酸氢二钾浓度的优化 分别在培养基中加入1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L浓度的K2HPO4，其他条件不变，发酵48h后稀释涂布，通过计算后的乳酸菌菌体数量，研究最适合乳酸菌生长的K2HPO4浓度。

1.2.2.4 碳酸钙浓度的优化 分别在培养基中加入5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L浓度的CaCO3，其他条件不变，发酵48h后稀释涂布，通过计算后的乳酸菌的菌体数量，研究最适合乳酸菌生长的CaCO3浓度。

1.2.3 发酵培养基的正交优化 根据单因素实验结果，分别选取设计4种组分：下脚料、红糖、磷酸氢二钾、碳酸钙的浓度进行4因素3水平共9个实验组的正交实验，其他条件不变，发酵48h后稀释涂布，通过计算后的乳酸菌菌体数量，来确定乳酸菌生长最佳的发酵培养基组合。

2 结果与分析

2.1 培养基单因素成分优化

2.1.1 下脚料的浓度对乳酸菌数量的影响 以水产下脚料为主体原料，改变培养基中下脚料浓度，结果如图1所示。从图1可以看出，最初随着鱼下脚料浓度的增加，乳酸菌数也随之增加，当鱼下脚料的浓度为250g/L时，乳酸菌的数量最多，达到0.187亿个/mL，而后随着下脚料浓度增加，活菌数略有降低但变化不大，所以无论从经济适用角度还是实验最优考虑，选用下脚料的浓度为250g/L的培养基发酵乳酸菌效果最佳。

2.1.2 红糖的浓度对乳酸菌数量的影响 鱼下脚料的浓度为250g/L的培养基，分别加入不同浓度红糖，发酵后，结果如图2所示。由图2可以看出，红糖作为碳源，随着红糖浓度的增加，乳酸菌数也随之增加，当红糖的浓度为80g/L时，乳酸菌的数量最大为6.7亿个/mL。所以选用红糖的浓度为80g/L的培养基发酵乳酸菌效果最佳。

2.1.3 磷酸氢二钾浓度对乳酸菌数量的影响 鱼下脚料的浓度为250g/L、红糖的浓度为80g/L的培养基，分别加入不同浓度磷酸氢二钾，发酵后，结果如图3所示。由图3可以看出，在磷酸氢二钾浓度为2g/L是乳酸菌数达到峰值6.12亿个/mL，而后随着磷酸氢二钾浓度的增加乳酸菌数缓慢增长，但最终也未超过浓度为2g/L时的乳酸菌菌体数，从经济适用角度和已知实验的最优角度考虑，培养基中加入的磷酸氢二钾浓度为2g/L是最优选择。

2.1.4 碳酸钙浓度对乳酸菌数量的影响 鱼下脚料的浓度为250g/L、红糖的浓度为80g/L、磷酸氢二钾浓度为2g/L的培养基，分别加入不同浓度的碳酸钙，发酵后，结果如图4所示。从图4可以看出，随着碳酸钙浓度的增加，乳酸菌数也随之增长，在碳酸钙浓度为20g/L时达到峰值，此时乳酸菌活菌数为9.8亿个/mL。由此得出碳酸钙浓度20g/L时发酵乳酸菌效果最佳。

2.2 正交实验优化乳酸菌的发酵培养基 选取培养基4种组分：下脚料、红糖、磷酸氢二钾和碳酸钙浓度等因素进行4因素4水平的正交实验，来确定发酵乳酸菌效果最佳的鱼下脚料发酵培养基，正交设计如表1所示。

从表2极差值的分析可看出，发酵培养基4种组分对乳酸菌发酵水平（活菌数量）影响大小依次为B>C>A>D，即红糖的浓度>磷酸氢二钾浓度>鱼下脚料的浓度>碳酸钙浓度。正交实验结果的最佳组合为A3B3C2D1，即发酵鱼下脚料的浓度为300g/L、红糖的浓度为100g/L、磷酸氢二钾浓度为2g/L、碳酸钙浓度为15g/L，最终乳酸菌数量达到9.5亿个/mL。

参考文献

[1]郑伟.鱼蛋白有机液肥的研发及其应用机理与效果的研究[D].杭州：浙江大学，2010.

[2]郑伟.方伟勇.低值鱼高值化研究进展综述[J].中国水产，2005，24（9）：70-71.

[3]郑伟.利巧低值鱼制备鱼蛋白液肥及其生物学效应的研究[D].杭州：浙江大学，2009.

[4]苑艳辉，钱和，姚卫蓉，等.鱼下脚料综合利用研究近况与发展趋势[J].水产科学，2004，11（23）：40-42.

[5]王文彬.渔类废弃物的加工与综合利用[J].畜产品加工，2006，14（10）：94-95.

[6]林瑞君，庄泽娟，刘斯雅，等.以嗜酸乳杆菌发酵虾头虾壳回收蛋白质和甲壳素的研究[J].农产品加工，2010，11：14-18.

[7]曾少葵，杨萍，陈秀红.微生物发酵对罗非鱼下脚料蛋白酶解液脱腥去苦效果比较[J].南方水产，2009（4）：62-67.