一种正弦波形变化光刺激器研制

刘亚丰,李源琦

(华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074)

一种正弦波形变化光刺激器研制

刘亚丰,李源琦

(华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074)

光遗传学方法为调控特定神经元及神经环路提供了一种新的途径，极大地推动了神经科学的发展。在利用光遗传学方法调控细胞时，通常需要正弦波形变化的光刺激信号。该文采用偏振激光器、半波片、偏振片及步进电机，搭建一套光强变化呈正弦规律的刺激器，其输出频率精准，最高频率可达89 Hz。实践表明，该技术方案将在光遗传学中有良好的应用前景。

光遗传学；光刺激；步进电机；正弦光波

大脑由上千亿个神经细胞相互连接构成复杂的神经网络，它们从上游细胞接收信息，经过传导、信息整合及计算，输出传至下游细胞。大脑细胞数量、种类之多，给大脑功能揭示及其对行为学调控带来巨大挑战。电生理学技术通过玻璃或金属电极刺激电极周围细胞，来分析研究这些细胞与行为活动之间的因果关系，但电极引入通常会给生物组织带来较大伤害，且由于自身材料限制，其空间分辨率较低，无法实现特定类型细胞的调控[1-2]。光遗传学技术是近十年新出现的一种神经调控技术，它通过基因靶向定位或病毒注射等技术，将光敏感蛋白特异性地表达在目标神经元胞体或突起上，在特定波长的光刺激下，引起神经元去极化产生动作电位，从而激活细胞，或细胞产生超极化，实现细胞活性的抑制，这种技术为特异性的双向控制特定神经元及神经环路提供一种新的选择，得以快速推广应用[3-6]。

利用光遗传学技术进行细胞调控时，通常要改变刺激光的频率、脉宽、功率等给特定神经环路或网络施加不同类型信号的输入，需要能够产生如正弦、方波、三角波等波形变化的刺激信号，以规范输入信号。调制发光二极管驱动电路虽可方便实现这些波形，但受到其发散角大的影响，无法实现大脑深层细胞的光刺激激活。

激光器由于有众多优点，广泛用于生物医学领域。对激光光强的调制，通常有内部调制和外部调制。内部调制即在激光器内部，通过加载特定电信号改变激光输出波形[7-8]，但这种内部调制方式使得激光功率稳定下来需要较长时间，激光波形波动较大，无法满足神经科学研究需要。外部调制方法通常可采用电光晶体、声光晶体、磁光晶体来实现[7-8]，但存在调制方式不易实现自动化调制、或输出波形信号不够精准、或器件成本较高等问题。激光器输出的通常是线偏振光，而半波片可调制激光偏振态，如果再结合偏振片，将很方便实现多种波形光信号的产生。另外这种方法成本低，控制易实现，输出激光信号能在毫秒水平稳定下来。本文基于以上原理，搭建一套正弦光波信号发生器，实验结果表明该方案将在光遗传学技术中有广阔的应用前景。

1 系统设计

如图1所示，设激光器输出线偏光光强为I1，沿着激光传输方向垂直光轴处放置一块特定波长的半波片。线偏振光垂直入射到半波片(其光轴为X方向)，则透射光仍为线偏振光。设入射激光振动方向与半波片光轴间夹角为α，则经过半波片后线偏振光振动方向从原来的方位转过2α角。在半波片后又垂直放置一块偏振片，其光轴与X轴夹角为β，通过该偏振片后的光强为I2，由马吕斯定律则可推导它们之间的关系如下：

图1 系统原理图

(1)

如果半波片以ω角速度做匀速转动，则t时刻半波片光轴转过的角度为ωt，则：

(2)

在初始位置，设定α=β，则：

(3)

由式(3)可以看出，激光光强随时间呈正弦规律变化，证明采用半波片和偏振片理论上是可行的。另外可知，正弦变化光波信号的频率是半波片转动频率的4倍。

在理论分析的基础上，搭建了实验测量系统，如图2所示，473 nm激光器(MLL-III-473，长春新产业光电技术有限公司)、半波片(GCL-060414，大恒新纪元科技股份有限公司)、三棱镜(GCL-030104，大恒新纪元科技股份有限公司)、偏振片(GCL-050003，大恒新纪元科技股份有限公司)、反射镜M1、M2、M3(GCC-102102，大恒新纪元科技股份有限公司)等依次摆放。半波片被固定在步进电机上用于匀速旋转，步进电机步距角为1.8 °，驱动设置为2细分。系统采用直角棱镜和3块反光镜对光路进行调整，实现出射激光与入射激光在同一传播方向上。光电池电路将激光信号变为电压信号，输入示波器(TDS1002，TEKTRONIX INC.)，用于观察和测量激光波形变化。

根据电机步距角、细分数，可知正弦光波频率f与步进电机驱动脉冲频率f0关系如式(4)所示：

(4)

2 实验数据及分析

当给步进电机发送脉冲信号时，如图3(a)所示，系统有稳定的光波信号产生，利用示波器可测得其强度呈正弦规律变化，如图3(b)所示，进而可测得正弦光波频率为步进电机脉冲频率的1/100。改变脉冲信号频率，正弦光波频率也相应改变，实际测量与理论计算具有较高的一致性，如表1所示。同时也发现，当步进电机脉冲频率过高时，实测正弦光波频率低于理论计算值，这可能是步进电机转速过高，发生丢步，导致电机转速比理论值偏慢造成的。

(a)系统结构示意图

(b)系统实物图 (c)直角棱镜与步进电机安装图2 实验系统图

实验测试表明，采用偏振光、半波片、步进电机可实现对连续激光输出进行调制，获得稳定的正弦变化光波。当给系统输入期望光波频率，系统能快速产生相应频率的正弦光波，如图4所示，相关系数为0.998，说明二者高线性，证明正弦波形变化光刺激器设计方案正确可行。

(a)步进电机脉冲发送波形图

(b)正弦光波波形图图3 实验数据分析

脉冲频率f0/kHz正弦光波频率f理论值/Hz正弦光波频率f实测值/Hz1.79818.018.42.11421.121.42.76227.627.33.74537.537.34.75347.547.65.33053.353.06.29763.062.27.35373.575.19.15791.688.9

图4 正弦光波信号实测频率与理论频率关系

3 结束语

光遗传学技术是遗传学技术与光刺激技术结合产生的产物，是一种精确调控细胞的方法，被《Nature Methods》杂志评为2010年最受关注的科技成果[9]，已被各个实验室广泛用于研究学习、记忆等高级认知功能[10]，有望用于帕金森氏病、阿尔茨海默病、精神分裂症等神经疾病的治疗[5]。

光遗传学进行光刺激时，不仅要考虑刺激光波长、功率，也需要考虑刺激光波形，使得调控细胞更接近细胞正常生理状态。对于刺激功率，通常不低于1 mW/mm2即可激活细胞[11-12]，常用激光器输出功率满足需求；对于波长，则要根据细胞表达的光敏感蛋白激发谱线来选取，对于兴奋性光敏感蛋白ChR2，可采用473 nm或488 nm波长激发，对于抑制性光敏感蛋白NpHR，可采用589 nm波长激发[3]；对于激光波形，可采用对激光进行内部或外部调制的方法获得正弦波、三角波等。本系统采用外部调制方法，利用激光器、半波片、偏振片及步进电机，搭建一套光强变化呈正弦规律的刺激器，通过改变步进电机转速可以快速获得期望频率的刺激光。该方案简单便捷、所需成本较低，在神经调控等领域有良好的应用前景。

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An Optical Stimulator Whose Intensity Change Follows the Sinusoidal Waveform

LIU Yafeng, LI Yuanqi

(College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

Optogenetics provides a new way to regulate and control the activity of specific neurons of neural circuits and thus greatly promotes the development of neuroscience.In the use of optogenetics methods to control cells, we usually require a light stimulation signal with sinusoidal waveform changes.In this paper, a set of sinusoidal wave signal generator is built based on a polarization laser, half-wave plate, polarizing plate and stepper motor.Its output frequency was very accurate and the highest frequency was up to 89 Hz.The experimental results demonstrate our technology scheme will have good application prospects in the field of optogenetics.

optogenetics; photostimulaiton; stepper motor; sinusoidal light waveform

2015-10-10；修改日期:2016-11-29

生物科学国家理科基地能力提高项目(NSFC-J1103514)；湖北省教学研究项目(2014070，2015060)。

刘亚丰(1976-)，男，博士，工程师，主要从事生物医学光子学、光遗传学、电生理学方面的研究。

O439

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2017.01.021