分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用探析

蔡金萍

摘 要：在当前的污水处理过程中，重点研究了微生物的处理方式，在污水生物处理的过程中，污水生物处理系统的地位是不可动摇的，但是在过去的研究过程中，对于微生物而言，存在着十分明显的缺陷，这主要是因为过去采用的技术手段过于单一，以纯培养技术为主，这样只能进行菌种分离，但是在污水生物处理的相关系统中含有较多的微生物菌群，这些菌群中蕴含着众多的微生物，所以在空间中聚集在一起，微生物并不是单一存在的，而是需要不断的竞争以及依存才能得到成长，所以在进行菌种分离以后，就无法创造这样一个空间，由此便出现了分子生物技术。

关键词：硝化菌群；分子生物技术；荧光原位杂交

分子生物技术的应用对于污水生物处理带来了一定的帮助，是现阶段应用比较普遍的一项技术手段，在进行污水生物处理的过程中，主要包含两个阶段，一个阶段是硝化，一个阶段是反硝化，这两个阶段都是脱氮的主要环节，在硝化过程中，主要的微生物是硝化菌群，其中包含了众多的微生物离子，在污水生物处理的过程中，主要依靠了生物活性以及稳定的菌群分布两个主要特点，这样才能促进污水生物系统中脱氮更加稳定的运行。在应用分子生物技术处理污水中硝化菌群的过程中，已经有相关研究项目对此展开了详细的分析，本文主要对此加以论述，希望对今后的研究工作带来一定的帮助。

1 基于FISH技术的分析方法

这一技术的应用主要是在目标微生物的基础上根据基因的特异性进行排列而成的，在设计的过程中，其中还含有寡核苷酸探针，具有荧光染料的特点，在碱基序列互补性的基础上，只要经过相应的杂交，就会显示出荧光信号，这说明杂交成功，在显微镜的显示下，可以对目的基因加以相对定量分析以及定性分析，在典型的FISH技术中，可以选择具有不同特异性序列的微生物加以检测，这样就可以对微生物群中的结构的变化情况进行研究，从而得出应有的信息。这种方法在污水生物系统中的应用是十分普遍的，并且随着信息技术的发展，这一技术也得到了进一步的完善。

以FISH-MAR技术为例，这一技术是建立在FISH技术基础之上的，因为单独采用FISH技术处理生物代谢等问题还存在一定的局限性，所以在现代化的应用过程中建立起了FISH-MAR技术，这一技术是通过显微照片的形式将生物的复杂性展示出来，清晰的显示出相应的菌群结构以及空间分布等问题，这一技术的核心在于可以在无机底物中加以培养，并且对具有放射性的细胞进行收集，在影像中所呈现出来的颜色是黑色，具体的实验流程是先将适量的污泥加入到血清瓶中，然后在血清瓶中加入适量的放射性标记底物，再经过2h的好氧培养，这样就可以得到污泥样品，将样品固定以后加以冲洗，经过FISH程序与MAR程序以后通过显微镜进行观察，得出相应的结论。

这种方式对微生物代谢与微生物群种结构的研究具有重要的意义，但是不足之处在于对目标含量较低的微生物结构来说并不适用，因为这种方式需要建立在荧光信号以及放射自显影的基础上，所以在活性污泥中，如果目标微生物的细胞过低，那么就会造成目标微生物的rRNA也具有较低的含量，这样就会对荧光信号产生一定的影响，不能得到正常的显影，进而无法准确的检测出结果。因此，如果硝化菌群无法呈现出优势菌群的特征时，那么就不适合采用FISH-MAR这一技术，即便是使用了这一方法，也无法获得显著的效果。

2 基于PCR技术的分析方法

2.1 amoA与16SrRNA基因

在应用这一技术的过程中，主要是选择具有进化标记的硝化菌群中的DNA序列进行研究，在这一序列的基础上，可以得知選择的分子标记基因为16SrRNA基因以及amoA。在对其进行研究的过程，这一技术所产生的影响是十分深远的，对于不同的微生物而言，16SrRNA在区域中所具有的差异也是十分明显的，其中可以分为两个组成部分，一个组成部分是古细菌，一个组成部分是细菌，在此基础上对微生物开展了更加深入的分析，在进行微生物分析的过程中，发现基因结构也是具有一定差异性影响的，16SrRNA自身具有保守性以及差异性的特点，通过上述的特点可以对系统发育以及相应的进化距离加以进一步的确定。

大部分AOB在分别基于amoA和16SrRNA基因的系统发育树上的分类有着高度的相似性。他们同时也发现，尽管对AOB的16SrRNA基因和amoA基因进行定性分析时都可以反映出环境中AOB的种类，但由于不同种AOB之间的16SrRNA基因序列的高度相似性和该类型引物的非特异性，限制了16SrRNA基因类引物对AOB菌群系统发育树分析的精确度。而尽管amoA不是制定系统发育树的因子，但由于amoA只存在于AOB中，而且不同种AOB的amoA序列差异度超过其16SrRNA基因的序列差异度，使得amoA类引物的扩增特异性更强，因此对AOB菌群遗传差异的分辨能力更高，从而能够更精确地分辩出AOB的种属。但无论是amoA类引物，还是16SrRNA基因类引物，目前都只针对β-变形菌纲的自养型AOB，因此在使用这两类引物对AOB进行分析研究时都会低估环境样品中AOB菌群的多样性。

2.2 PCR-T-RFLP

PCR-T-RFLP（PCR-terminal restriction fragment length polymorphism，PCR-末端限制性片段长度多态性）技术是对PCR扩增过程中所使用的引物一端用荧光物质进行标记。当用该引物对样品DNA进行PCR扩增后，PCR的扩增产物就带有了荧光标记。然后选择适当的限制性内切酶对PCR产物进行消化，就可产生不同长度的限制性片段。传统的T-RFLP技术通常只使用一条带有荧光染料的引物和一种限制性内切酶。随着该技术的改进，有的研究者会同时使用两条带有不同荧光染料的引物进行PCR扩增，从而提高目标微生物的分类水平。最后利用DNA自动测序仪和带有其它荧光染料标记的内标物对消化产物的长度进行分析，并获得峰值图。由于每种微生物带荧光标记的限制性片段长度唯一，所以峰值图中每一个峰至少代表一种微生物，每个峰面积与峰总面积的比值代表这种微生物的相对含量。相对于PCR-DGGE技术，PCR-T-RFLP技术能在相对较短的时间内对大量样品的菌群结构进行分析。PCR-T-RFLP技术还具有较好的重现性和更高的灵敏度，从而该技术能够对样品中含量较少的微生物进行研究。

3 结论与展望

分子生物技术在污水生物处理系统内硝化菌群研究中的应用，从微生物学角度更本质地揭示了影响污水生物处理系统硝化性能的因素。本文提到的分子生物技术在污水处理中脱氮除磷相关机理和理论的研究中也有着广阔的应用前景，如短程脱氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厌氧氨氧化等。通过这些技术可以识别特定生物代谢过程的微生物种群；建立目标菌群动态变化与工艺运行参数之间的相关关系；从微生物学角度对系统运行状态给予最直接、最可靠的分析与证明，为污水生物脱氮除磷系统的长期稳定运行奠定理论基础，提供借鉴与指导。

参考文献

[1]文伟河.我国开发出二元复合结构生活污水生物处理装备[J].生物加工过程，2009（04）.

[2]胡锋平，王全金，兰蔚，陈鹏，陈红岩.污水生物处理实验室建设在教学实践中的应用[J].华东交通大学学报，2005（S1）.