常用杀菌剂对啶虫脒中华蜜蜂毒性潜在增效作用研究

韩文素，任承才，高景林，齐帮亚，王释婕，赵珊，钟义海，赵冬香,*

1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101 2. 河北农业大学植物保护学院，保定 071000 3. 中国热带农业科学院蜂业技术研究中心，海口 571101 4. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228

蜜蜂是自然界最主要的授粉昆虫，蜜蜂授粉每年给中国的农业生产贡献3 042.20亿元，相当于全国农业总产值的12.30%，全国农林牧渔总产值的6.18%[1]。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国主要授粉昆虫之一，在维持我国农业经济发展和生态平衡方面发挥着重要作用[2]。近年来，全球范围内蜜蜂数量的骤减引起了业界的广泛关注。中华蜜蜂在我国的分布区域和种群数量也显著减少，致使一些植物授粉总量减少，生物多样性降低[3]。

蜜蜂农药中毒的发生，是当前野生蜂和人工饲养蜜蜂种群面临的严峻问题。由于全球气候变暖，农业集约化种植，农作物病虫害发生日趋严重，从而化学农药的施用更加频繁。农户常常在作物不同生长期喷施不同药剂，或为了节省时间、劳力将多种药剂混在一起施用[4]。在此环境条件下，蜜蜂可能先后或同时暴露在多种农药的威胁中。杀菌剂是蜜蜂和其他传粉昆虫最常接触的一类化合物，因杀菌剂通常施用在蜜源植物的盛花期，而这类作物对采集蜂具有极高的吸引力[5]。因此采集蜂有可能将杀菌剂污染的花粉、花蜜带回蜂巢，危害幼虫的存活[6-7]。一些杀菌剂在环境中相当稳定，在蜂房花粉和蜂蜡中常常检测到高残留的杀菌剂[8]。

新烟碱类杀虫剂具有内吸性、高选择性，是近年来发展最快、使用最为广泛的一类杀虫剂。其施药方式多样，可用于喷雾、种子处理、撒施、沟施、穴施和投放。但研究表明，大多数新烟碱类杀虫剂对蜜蜂高毒，纳克级甚至更低水平即会对蜜蜂产生影响[9-12]，除急性死亡外，还可导致亚致死效应，如引起蜜蜂运动性能紊乱，干扰蜜蜂神经系统，影响生长发育和繁殖，损害记忆和学习能力以及采集和归巢能力等[9, 12-15]。由于具有内吸性，新烟碱类杀虫剂可被植株转运到植物的花粉、花蜜和吐水液中[16-17]。当作物上喷洒杀菌剂时，蜜蜂也会暴露于新烟碱和杀菌剂的混合物中。

啶虫脒属氯化新烟碱类化合物，对蜜蜂毒性为中毒[18-19]，被广泛应用于果园、菜地、棉田等经济作物。由于啶虫脒的相对“友好”(对蜜蜂急性毒性较低)，导致了其更加宽泛的使用标准，如允许在作物花期使用等[20]。Tong等[21]在对54份花粉样品的检测中检测到8份含有啶虫脒残留，最高剂量为63.60 ng·g-1，点滴10 μg·bee-1的氟菌唑、丙环唑能分别提高啶虫脒对意大利蜜蜂的毒性至244倍和105倍[22]，这意味着花粉、花蜜中残留极低的氯化新烟碱类药剂，若再喷洒杀菌剂，极有可能对蜜蜂产生毒性影响。研究证实，麦角甾醇合成抑制剂(ergosterol biosynthesis inhibitor, EBI)类杀菌剂能够提高部分新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性[22-23]。Thompson认为，接触田间实际暴露剂量的戊唑醇与噻虫嗪混剂、氟硅唑与噻虫嗪混剂分别使噻虫嗪对意大利蜜蜂的毒性增效2.6倍和2.3倍；摄入田间实际暴露剂量的戊唑醇和噻虫胺混剂，使噻虫胺对意大利蜜蜂的毒性增效1.9倍[24]。

在作物授粉生产实践中，常常有蜜蜂中毒事件的发生，而啶虫脒和各种杀菌剂往往在作物花期也会使用，基于此，本文在实际调查的基础上，研究了几种常用杀菌剂的实际暴露量对啶虫脒的中华蜜蜂毒性潜在增效作用，为更好地了解农药对授粉蜜蜂的影响，进一步指导花期合理使用农药奠定必要基础。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 试验材料

供试昆虫：健康成年的中华蜜蜂蜂群，来源于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所试验蜂场(N19°32'，E109°32')。供试蜜蜂在试验当天清晨收集，要求为健康、大小一致的个体。

供试药剂：98.2%啶虫脒原药、97%咪鲜胺原药、95.1%氟硅唑原药、97%吡唑醚菌酯原药、96.2%腈菌唑原药、96%苯醚甲环唑原药、95%三唑酮原药、96%嘧菌酯原药、95.6%己唑醇原药、95%丙环唑原药、97.1%戊唑醇原药，均由海南博士威农用化学有限公司提供。

供试试剂：75%乙醇、丙酮均为化学纯，购自广州化学试剂厂，蔗糖购自海南椰威糖业有限公司。

所需仪器设备：试验蜂笼(13 cm × 6 cm × 10 cm的长方体钢盒，正面为玻璃板，顶部有饲喂口，底部有通风口)，TLE204E电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，BILON-XH-D涡旋混匀器(上海比朗仪器制造有限公司)，自制人工气候室(面积3.8 m2)。

试验条件：温度(27 ± 1) ℃、相对湿度50%～70%、黑暗条件。

1.2 试验方法

据Koch和Weißer[25]报道，法色草田间喷洒20 g tracer·ha-1荧光素钠，测得蜜蜂体内最大残留量为35.77 ng·bee-1。因此本试验根据每种杀菌剂的田间最大推荐剂量，按照上述文献计算出每种杀菌剂每只蜜蜂的实际暴露剂量(表1)。然后参照《化学农药环境安全评价试验准则》第10部分：农药对蜜蜂急性毒性试验(GB/T 31270.10—2014)[26]，采用接触法和摄入法测定啶虫脒、杀菌剂+啶虫脒对蜜蜂的接触毒性和经口毒性，比较杀菌剂存在情况下啶虫脒对中华蜜蜂的LD50与啶虫脒单独对中华蜜蜂的LD50，以确定增效比。

表1 试验杀菌剂及每只蜜蜂实际接触剂量Table 1 The test fungicides and the realistic exposure dose per bee

1.2.1 急性接触毒性

分别测定啶虫脒、杀菌剂+啶虫脒对中华蜜蜂的急性接触毒性。考察杀菌剂对啶虫脒协同增效的急性接触毒性时，为了使杀菌剂充分进入蜜蜂体内，最大限度地抑制杀虫剂代谢[22]，点滴啶虫脒前先点滴杀菌剂。过程如下：

在预实验浓度的基础上，分别用丙酮将啶虫脒配制成5～7个系列浓度药液(级差小于2.2)，将供试杀菌剂配制成所用浓度。实验前，将配制好的药液充分涡旋混匀。将度过适应期的蜜蜂用冰箱低温麻醉(约2 min)后，迅速用移液器点滴1 μL所试杀菌剂在蜜蜂的中胸背板处，对照点滴1 μL丙酮，蜂身晾干后转入塑料杯。待蜜蜂完全苏醒后，再次低温麻醉，分别点滴1 μL各浓度啶虫脒药液，对照再次点滴1 μL丙酮。待药液晾干后转入试验笼中，用脱脂棉浸50%蔗糖溶液饲喂。只考察啶虫脒的急性接触毒性时，仅点滴1 μL各浓度啶虫脒药液。每个处理3次重复，每个重复10只蜜蜂。

1.2.2 急性经口毒性

分别测定啶虫脒、杀菌剂+啶虫脒对中华蜜蜂的急性经口毒性。在预实验浓度基础上，分别用50%的蔗糖水溶液将啶虫脒溶解并配制成5～7个系列浓度药液(级差小于2.2)，将供试杀菌剂配制成一定浓度。实验前，分别将杀菌剂药液与不同浓度啶虫脒药液混合成所需浓度，并充分涡旋混匀。将度过适应期的蜜蜂用冰箱低温麻醉(约2 min)后，放入试验笼中饥饿2 h，然后饲喂200 μL不同浓度药液。只考察啶虫脒的急性经口毒性时，仅饲喂200 μL不同浓度啶虫脒药液。一旦药液消耗完(通常需要3～4 h，最多延长至6 h)，将饲喂器取出，换用不含药剂的蔗糖水溶液进行饲喂(不限量)，并对每组药液的消耗量进行测定。同时设空白对照(50%蔗糖水溶液)，每个处理设3次重复，每个重复10只蜜蜂。

1.2.3 蜜蜂中毒症状及死亡数考察

于试验开始后24 h和48 h，分别观察和记录蜜蜂死亡数、中毒症状。用毛笔轻触中毒蜜蜂，蜜蜂不能运动即视为死亡。

1.2.4 数据处理

根据试验期间死亡数及死亡时间，采用SPSS 19.0统计软件处理数据，得到LD50和95%置信限。计算杀菌剂+啶虫脒与单独使用啶虫脒之间的毒性关系(即毒性倍数：杀菌剂的协同增效毒性倍数=啶虫脒的LD50值/杀菌剂+啶虫脒的LD50值)。

1.2.5 毒性等级划分标准

参照我国《化学农药环境安全评价试验准则》第10部分[26]，将农药对蜜蜂的急性毒性共分为4个等级：(1) LD50≤ 0.001 μg a.i.bee-1，为剧毒；(2) 0.001 μg a.i.bee-1﹤LD50≤ 2.0 μg a.i.bee-1，为高毒；(3) 2.0 μg a.i.bee-1﹤LD50≤11.0 μg a.i.bee-1，为中毒；(4) LD50﹥11.0 μg a.i.bee-1，为低毒。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 啶虫脒对中华蜜蜂的毒力

啶虫脒单独对中华蜜蜂的24 h、48 h接触毒性分别为4.499和2.484 μgbee-1(表2)；啶虫脒单独对中华蜜蜂的24 h、48 h经口毒性分别为3.208和1.418 μgbee-1(表3)。按照农药对蜜蜂的毒性分级标准，啶虫脒对中华蜜蜂的接触毒性为中毒，48 h后的摄入毒性为高毒。

2.2 杀菌剂对接触毒性的增效作用

从表2可以看出，以田间实际暴露的杀菌剂剂量预处理中华蜜蜂，各杀菌剂对啶虫脒的毒性均有不同程度的增加。其中咪鲜胺使啶虫脒的24 h毒性提高14.02倍，48 h后提高8.01倍；丙环唑使啶虫脒的24 h毒性提高10.74倍，48 h后提高10.14倍；戊唑醇使啶虫脒的24 h毒性提高7.92倍，48 h后提高7.09倍；腈菌唑使啶虫脒的24 h毒性提高8.50倍，48 h后提高4.80倍。毒性增加最小的为氟硅唑，24 h提高2.67倍，48 h后提高1.49倍。48 h后啶虫脒对中华蜜蜂的接触毒性LD50均﹤2.0 μg a.i.bee-1，根据农药对蜜蜂的急性毒性分级标准，在接触杀菌剂的条件下，啶虫脒的毒性演变为高毒。根据48 h的毒性增加倍数，杀菌剂增效的潜力依次为：丙环唑 > 咪鲜胺 > 戊唑醇 > 腈菌唑 > 己唑醇 > 吡唑醚菌酯 > 苯醚甲环唑 > 嘧菌酯 > 三唑酮 > 氟硅唑。

2.3 杀菌剂对经口毒性的增效作用

从表3可以看出，中华蜜蜂摄入实际暴露剂量的杀菌剂和啶虫脒混剂，啶虫脒的毒性具有一定程度的增加。处理24 h后，丙环唑对啶虫脒的协同增效水平最高，为3.62倍，其次为氟硅唑，毒性增加2.46倍，且LD50的置信区间无重叠。处理48 h后，氟硅唑使啶虫脒的毒性提高到2.81倍，嘧菌酯使啶虫脒的毒性提高2.58倍，且LD50的95%置信区间无重叠。增效最不明显的为戊唑醇，其次为己唑醇，LD50的95%置信区间明显重叠。

表2 啶虫脒及啶虫脒与杀菌剂联合对中华蜜蜂的接触毒性Table 2 Contact toxicities of acetamiprid and its fungicides combinations on Apis cerana cerana

表3 啶虫脒及啶虫脒与杀菌剂联合对中华蜜蜂的经口毒性Table 3 Oral toxicities of acetamiprid and its fungicides combinations on Apis cerana cerana

3 讨论(Discussion)

新烟碱类杀虫剂对蜜蜂存在较高的毒性和风险性，欧盟委员会2013年初禁止吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺在玉米、油菜、向日葵和棉花上使用[27]。啶虫脒对西方蜜蜂的急性毒性较低(对意大利蜜蜂急性经口毒性LD50为15～17 μgbee-1，急性接触毒性LD50为8.1～39 μgbee-1)[20]，因此其使用标准比较宽泛。本文研究表明，啶虫脒对中华蜜蜂的急性接触毒性为2.484 μgbee-1(48 h)，为中毒；急性经口毒性为1.418 μgbee-1(48 h)，为高毒。文献研究表明，啶虫脒对意大利蜜蜂的急性接触毒性LD50为8.22 μgbee-1，急性经口毒性LD50为6.34 μgbee-1[28]。可见，蜜蜂遗传背景不同，对药剂的敏感性不同，中华蜜蜂相对于意大利蜜蜂对药剂更加敏感。

农药的混合物普遍存在于开花作物及其附近的野花上[29]，在蜂体及蜂产品检测中也经常发现各类杀虫剂和杀菌剂[8,21]，而蜜蜂花粉和熊蜂花粉中发现最多的农药是杀菌剂[29]。虽然杀菌剂一般对蜜蜂低毒[30]，但近年研究发现，田间喷洒最大推荐剂量的商品制剂Pristine(12.8%吡唑醚菌酯和25.2%啶酰菌胺混剂)，会干扰雌性独栖蜂壁蜂(Osmia lignaria)和切叶蜂(Megachile rotundata)的巢识别能力[31]。本课题组研究表明，亚致死剂量腈菌唑会影响中华蜜蜂的呼吸和P450酶活性(数据另文发表)。杀菌剂与杀虫剂结合，会产生不同程度的协同效应，例如，点滴10 μgbee-1的氟菌唑，能够使噻虫啉对意蜂的急性毒性提升1 141倍[22]；点滴3 μgbee-1咪鲜胺、丙环唑、腈苯唑、叶菌唑、腈菌唑使氟胺氰菊酯的毒性提高12～74倍[23]。

目前，农药对蜜蜂毒性影响的争论关键点即为蜜蜂在田间可能的暴露剂量。由于很多实验室和半田间研究使用了不切实际的高剂量农药，导致研究结果被摒弃[29]。因此本研究采用蜜蜂在田间可能的最大暴露杀菌剂剂量来测定不同杀菌剂对啶虫脒的协同效应，结果表明，先点滴杀菌剂后，所有供试杀菌剂均使啶虫脒的毒性不同程度的增加；不同杀菌剂与啶虫脒混用，丙环唑、咪鲜胺、戊唑醇、腈菌唑使啶虫脒的毒性增加。丙环唑、戊唑醇、腈菌唑为三唑类脱甲基抑制剂，咪鲜胺为咪唑类脱甲基抑制剂，均属于麦角甾醇生物合成抑制剂。这类杀菌剂通过抑制病菌麦角甾醇的生物合成，从而破坏细胞膜的功能，导致细胞死亡[32]，其增效机理为通过抑制细胞色素P450解毒活性从而提高杀虫剂的毒性[23]。

本试验结果表明，作物花期喷施啶虫脒和杀菌剂(尤其是唑类杀菌剂丙环唑、咪鲜胺、戊唑醇、腈菌唑等)对中华蜜蜂采集蜂产生较高的毒性和风险性。因此在生产实践中用药时应避免这几种杀菌剂与啶虫脒混和喷施以及相隔很短时间前后施用。作物花粉花蜜中残存的亚致死剂量新烟碱类杀虫剂与杀菌剂混合是否影响采集蜂的生理、行为和授粉效率，有待进一步研究。

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