兽药类环境内分泌干扰效应及评价研究进展

姜锦林，单正军，卜元卿，韩志华，王娜

国家环境保护农药环境评价与污染控制重点实验室，环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042

兽药也称兽用药或动物用药，是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质(含药物饲料添加剂)；根据使用目的,兽药大致可归纳为4类：1)一般疾病防治药；2)传染病防治药；3)体内、体外寄生虫病防治药；4)饲料添加剂(包括促生长药)。其中除防治传染病的生化免疫制品(菌苗、疫苗、血清、抗毒素和类毒素等)，以及畜禽特殊寄生虫病药和促生长药等专用兽药外，其余均与人用医药相同，只是剂量、剂型和规格有所区别。

兽药在保障动物健康、提高畜禽产品质量尤其在畜牧业集约化发展等方面起着至关重要的作用，然而兽药和饲料添加剂的大量使用成为生态环境污染和人体健康损害的一个重要因素。一方面，大量外源性化学物进入畜禽产品中，使动物性食品中药物残留越来越严重，对人类的健康和公共卫生构成威胁；另一方面，大部分兽药和添加剂以原药和代谢产物的形式经动物的粪便和尿液进入生态环境中，对土壤、地表水、地下水等造成污染，影响植物、动物和微生物的正常生命活动，并通过食物链最终影响人类的健康。研究表明，很多作为促生长剂而广泛应用于养殖业的人工合成雌激素类兽药是典型的环境内分泌干扰物。这类物质脂溶性强，在水源和土壤中很难降解，可以通过食物链进入生物体内，对人类的健康及生物的生存产生巨大影响[1-5]。

所谓内分泌干扰物(endocrine disruptors)，一般是指环境中存在的能够干扰生物体内源激素的合成、释放、转运、结合、作用或清除，从而影响机体的内环境稳定、生殖、发育及行为的外源性物质[6]；环境中存在的多种内分泌干扰物与生物体内天然激素受体选择性结合而产生的如上所述的多种生物效应，即内分泌干扰效应。环境中的许多化合物具有内分泌干扰作用，这些化学物质性质差异极大，包括难降解的持久性有机污染物(如多氯联苯、二噁英、有机氯农药等)和易分解的极性杀虫剂、除草剂、洗涤剂降解产物、动物及人类排泄的激素、天然植物激素、微生物毒素以及某些重金属等。值得注意的是，广泛使用的口服避孕药和一些用于家畜助长或免疫的同化激素(兽药)中含有大量的人工合成雌激素，如己烯雌酚、乙烷雌酚、炔雌醇等[2]。近年来，人们认为许多健康受损现象的发生均与环境雌激素有关，包括：人类隐睾症与尿道下裂等疾病发病率提高，男性平均精子数量减少，女性不孕明显上升，水生动物出现雌性化现象等[7-9]。兽药污染造成的内分泌干扰风险因此引起国内外政府机构、专家学者的高度重视。正是在这样的背景下，本文调研了典型兽药的污染现状及其内分泌干扰效应研究最新进展，并以传统环境内分泌干扰物的研究方法为基础，较全面地评述了可用于兽药类内分泌干扰物的快速筛选、检测及评价方法，并对该领域未来研究提出了展望和建议，以期为环境和农业等管理部门制定兽药的使用、排放、管理政策提供科学依据，促进我国畜禽养殖业的可持续性发展。

1 兽药在环境中的残留现状(Veterinary drup residus in the environment)

随着集约化养殖业的发展，兽药和饲料添加剂的使用量正日渐增加，动物在使用药物以后，药物将以原形化合物或代谢产物的方式从粪、尿等排泄物进入外界环境，造成环境土壤、表层水体、植物和动物等的兽药蓄积或残留。近年来，世界范围内的土壤、地表水及地下水中都有低浓度的兽药检出，抗生素及驱虫药物对生态环境的潜在危害尤为突出。

抗生素和激素类兽药也可通过污染食品而进入环境，如预防和治疗畜禽疾病用药和促进生长、泌乳、甚至肌肉脂肪分配而使用的药物，这些药物主要通过口服、注射、局部用药等方法给药，药物由于残留动物体内而污染食品；此外，残留大量兽药的动物粪便和污水处理厂的污泥用于农田施肥，也会污染土壤和水体；在水产养殖业中，药物作为饲料添加剂或通过水中撒药形式给药而被直接投加到水中，据统计，70%以上的药物可通过这种途径直接进入到水环境。20世纪90年代末，欧洲的一些国家开始比较系统地调查、研究环境中兽药的残留和污染问题，我国起步较晚，直到近年来才开始广泛关注兽药残留对生态环境和人体健康的危害。表1显示了常见抗生素和激素类兽药在环境中的残留现状[4,10-12]。此外，与其他环境介质相比，一些抗生素和激素类兽药，如氟喹诺酮类(FQs)抗生素，在污泥中的污染更加严重。对北京8个污水处理厂的调查发现，污泥中氧氟沙星残留浓度高达21 mg·L-1，而国外FQs在污泥中普遍检出浓度在0.04～8.3 mg·kg-1范围内[13-14]。畜禽粪便中，抗生素和兽药污染更是普遍严重，曾有学者检测到我国猪粪中恩诺沙星浓度高达33.26 mg·kg-1[14]。可见，我国抗生素和兽药类污染已相对严重。

由此可见，兽药污染已成为一个全球性普遍存在的问题，大多数兽药具有较高的生物活性，其必然存在一定的潜在生态环境风险。尤其是抗生素和激素类兽药残留对生态系统和人体健康的威胁日益暴露。

2 兽药内分泌干扰效应研究现状(Research status of veterinary endocrine disrupting effects)

2.1 内分泌干扰物分子作用模式

内分泌干扰物的分子作用模式主要是具有与生物体内源激素相似结构的外源化学物质通过结合细胞外受体，转运至细胞核内同启动子位置结合，从而启动目的基因的表达，因而可模拟、阻止或干扰雄激素、雌激素、甲状腺激素等内分泌过程，此途径称之为受体介导途径[6, 15]。此外，环境中还存在大量化学物质，其化学结构与生物体内源激素结构并不相同，但也可表现出内分泌干扰物效应。这可能是污染物直接影响了生物体内的与激素合成相关酶的活力，以及通过破坏内源激素及其受体的生成、代谢、转运、信号转导等途径，从而干扰生物体内内分泌，如许多化学物质可通过干扰与类固醇激素生物合成路径中相关的基因表达和酶的活力影响性激素的含量，这些作用称之为非受体介导途径[6, 15]。

对于环境内分泌干扰物的研究，长期以来集中在污染物对动物生殖器官的作用。然而，生物机体的生长发育、繁殖等受内分泌系统和体内复杂信号通路的调控，这种调控方式常以网络的形式存在，互相影响并相互补偿，以应对环境因子的影响。在脊椎动物体内，下丘脑-垂体-性腺/甲状腺/肾上腺轴在动物的繁殖、生长发育、免疫等发挥着重要的调控作用。大脑作为控制内分泌系统的核心综合部位，发育中的神经系统对于内分泌干扰物的作用非常敏感。因此，环境内分泌干扰物可能对动物完整内分泌系统产生作用，影响动物的生长发育及繁殖等。另外，神经内分泌系统也是许多有机污染物作用的主要靶器官之一，这些物质可以引起大脑永久性的结构及功能的改变，直接影响内分泌功能[6]。

表1 常见抗生素和激素类兽药在环境中的残留Table 1 Veterinary antibiotics and hormone residues in the environment

2.2 典型兽药的内分泌干扰效应研究

2.2.1 己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)

DES是一种非甾体类雌激素，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。DES曾作为促生长剂而广泛应用于畜禽生产中，Lorenz等[16]首次报道给小公鸡皮下植入DES，8周后公鸡的胸部和腿部肌肉脂肪含量增加了3倍；Rumsery等[17]试验结果证明肉牛通过每日口服10 mg DES，能增强体内蛋白质沉积和增加日增重，可以很快产生显著和直接的经济效益。除欧盟以外的许多国家：如美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等都曾把人工合成雌激素(主要是DES)用作促生长剂。

DES是亲脂性物质，性质较稳定，不易降解，易在人和动物脂肪及组织中残留，长期服用会导致肝脏损伤。DES具有明显的毒副作用，DES应用早期就曾有人报道过DES对小鼠具有致癌性，但当时没有引起人们的重视。直到20世纪70年代，大量的动物试验才证明在孕期服用DES会增加其后代患生殖道癌症的风险，如阴道和子宫颈透明细胞腺癌、阴道癌、子宫内膜癌、睾丸异常等。研究表明，与DES致癌性关系最密切的是女性阴道和子宫颈透明细胞腺癌。此外，DES还会导致阴道癌、子宫内膜癌和乳腺癌等，现在大多数女孩月经初潮明显提前也与DES有关；孕期服用DES不仅对女性后代造成严重危害，对男性后代的危害更是不可忽视。妇女孕期服用DES易导致男性后代睾丸异常、发育不全、精子计数减少和精子活力下降等一系列生殖系统问题；孕期服用DES会导致胎儿早产，影响胎儿性别分化和生长发育，还会导致胎儿脑瘫痪、失明和其他神经缺陷[18]。

动物实验表明，Mikkilä等[19]就新生小鼠睾丸组织对DES的敏感性进行研究，结果发现所有接触过DES的小鼠其血液中的睾丸激素均减少。长期摄入DES会导致雄性雌性化，造成严重的“阴盛阳衰”。Shukuwa等[20]发现，DES会导致雄鼠催乳素细胞密度明显增加。当水体中DES 浓度为1 ng·mL-1时，可导致雄性日本青鳉两性化，5～10 ng·mL-1则完全雌性化[21]。对真鲷幼鱼的雌激素效应研究表明，暴露于一定浓度(0.08、0.8、8.0 μg·L-1)DES 42 d，真鲷幼鱼的肥满度均极显著下降，血浆中卵黄蛋白原被诱导产生，肝胰脏指数和血浆蛋白总量显著升高，显示DES具有明显的雌激素效应[22]。新生期注射DES后在BALB/c小鼠中脾细胞黄体生成素的表达显著减少，且雌性小鼠对DES的敏感性大于雄性小鼠，表明DES能影响小鼠的免疫器官[23]。用量为0.3和3 mg·kg-1的DES能促使幼年香猪睾丸生殖细胞数显著增多，而使睾丸支持细胞数量显著减少；不同剂量的DES都具有促进幼年香猪睾丸和附睾中肥大细胞增多的作用，且具有剂量相关性[24-25]。此外，己烯雌酚还能诱导泥鳅红细胞产生异形细胞、异常核和微核，说明己烯雌酚对泥鳅红细胞的形成有明显的致突变作用[26]。

2.2.2 喹乙醇

喹乙醇属于喹噁啉类，是一种曾在畜禽及水产养殖中广泛使用的抗菌促生长剂，是我国养殖饲料中最常用的兽药及饲料添加剂之一，其不仅对于鱼类和禽类具有较强的急性毒性作用，而且作用于动物后会严重损害动物肝肾组织，引起机体生理生化指标的变化等亚慢性毒性反应。喹乙醇以原形或代谢物的方式从动物粪、尿等排泄物进入生态环境，或者以渔场水体直接用药的方式，造成土壤环境、表层水体、水生和陆生生物的喹乙醇残留蓄积，进而引起生态毒性。在实际生产中，喹乙醇由于不当用药而引起养殖动物中毒甚至死亡的现象时有发生。

据报道，喹乙醇对大型蚤(Daphnia magna)的急性毒性较强，作为渔场的饲料添加剂，喹乙醇对水环境有潜在的不良作用[27]。此外，喹乙醇还可显著影响斑马鱼的胚胎发育过程，有明显的致畸作用；可以引起鲤鱼肾细胞DNA的明显损伤，致染色体断裂，具有潜在的遗传毒性，应该严格控制喹乙醇在水产养殖中的使用，消除其对鱼类等水生生物、人体和环境的潜在危害[28]。近些年的研究表明，喹乙醇还对内分泌免疫系统产生作用，通过原代细胞培养，高于0.3 μg·mL-1浓度的喹乙醇可显著导致草鱼肝细胞和胰腺外分泌部细胞的脂肪积累，抑制草鱼胰腺外分泌部细胞胰蛋白酶原的合成；当添加喹乙醇1.8 μg·mL-1时，可导致部分草鱼胰腺外分泌部细胞形态发生病理变化[29]。给小鼠灌喂不同剂量喹乙醇，发现大剂量喹乙醇会抑制机体的红细胞免疫功能；小鼠的胸腺指数和脾指数随着喹乙醇剂量的增大均不同程度降低，说明大量使用喹乙醇可能会抑制胸腺的发育，对脾脏的重量也有一定影响，致使小鼠的免疫机能下降[30]。

2.2.3 大豆异黄酮

大豆异黄酮是植物雌激素，黄酮类化合物中的一种，主要存在于豆科植物中，大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，可通过与雌激素受体(ER)结合表现出雌激素的生物学活性，缓解围绝经期妇女的临床症状；可促进和诱导淋巴细胞的转化与增殖，维持自身免疫稳定性和巨噬细胞的吞噬能力，增加围绝经期妇女的免疫功能[31]。大豆异黄酮作为一种新型的饲料添加剂，具有良好的抗病和促生长作用，能增强机体免疫力，提高产奶量，改善乳品品质，且在一定程度上还有无污染、无残留、无抗药性等优点，但是就其是否会增加乳腺癌、子宫内膜癌以及对生育能力产生影响仍存在很大的争议，还需进一步研究。吴静等[29]研究表明，大豆异黄酮可增加卵巢大鼠血清E2水平，作用稍弱于传统雌激素，但可以明显增加CD3+淋巴细胞数、CD4+淋巴细胞数、CD4+/CD8+细胞比例的值和胸腺的重量。近期研究表明，大豆异黄酮能影响雄性生殖激素分泌、睾丸和附睾组织的生长发育、睾酮合成相关酶的活性以及大脑中生殖激素基因的表达，并与剂量有关，对雄性动物生殖系统可能产生的不良作用不容忽视。

大多种内分泌干扰药物的长期毒害效应体现在它们具有传代效应，这其中牵涉到表观遗传状态的改变。激素类兽药引起传代效应的一个重要机制就是引起DNA甲基化图式的改变。烯菌酮是一种杀菌剂，也是环境激素的一种，暴露于烯菌酮或其他几种物质中的水蚤的DNA甲基化水平会发生稳定持续地降低，且这种变化可在其后代没有受过其影响的世代中出现[33]。烯菌酮处理F0代鼠后，在F3代鼠的精子中也会发现DNA甲基化状态的改变，证明潜在的间接遗传异常现象和表观遗传传代继承的存在[34]。暴露于17α-炔雌醇一段时间后，成年斑马鱼肝脏中卵黄蛋白原I基因的5'侧翼的甲基化水平下降，表明由雌激素诱导的卵黄蛋白原表达涉及到DNA甲基化水平的改变[35]。

从目前的研究报道来看，大多数试验得到的兽药对生态环境的毒性效应经常是在大大高于实际环境浓度的情况下得到的，观察到的多数是药物的急性毒性结果，而实际环境浓度条件下兽药的生态毒性较小，但是应该考虑到，部分兽药持续地进入环境且难以降解，加之环境污染物常以低剂量复合形式存在，其对生物的潜在影响常常是难以通过短期的试验观察到的，因此需建立可靠的低剂量复合长期暴露的方法学，关注激素兽药的低浓度复合作用下的内分泌干扰作用研究。为降低兽药应用风险，应该研究减少、避免和消除兽药在生态环境中残留的方法和措施。通过完善兽药监控体系，加大行政执法力度，优化畜禽的给药方案，研制和推广使用天然药物等方法，减少或避免兽药残留。

3 可应用于兽药类内分泌干扰物筛选的方法建议(Proposal of screening method for veterinary drug class of endocrine disruptors)

就目前已建立的较成熟的环境内分泌干扰物的快速筛选和检测方法，可以归为4大类研究方法：模型动物筛选法、组织器官筛选法、细胞筛选法和分子筛选法[36]。具体筛选和检测方法可应用于兽药类内分泌干扰物的研究，下面就其中可用于评价兽药内分泌干扰效应的指标，分别阐述如下：

3.1 模型动物筛选法

主要包括大鼠子宫增重法和水生生物形态学变化观察法。大鼠子宫增重法步骤固定且筛选程序简单，是最为成熟的筛选检测环境雌激素的体内实验方法之一，选用未成熟的雌幼鼠或摘除卵巢的雌成鼠为研究对象，以口服或皮下注射的方式，将实验动物连续3～4 d暴露于待测化学物质，然后剥离受试对象的子宫并测定对照组与实验组子宫的脂肪、干重或湿重与体重的比值，进而评价待测化学物质是否具有促进子宫生长的作用，判断其是否具有雌激素效应[37,38]。而水生生物形态学变化观察法则是选用鱼类或甲壳类动物等水生生物作为模型生物，根据其形态特征的改变用于筛选具有雌激素活性及雄激素活性的化学物质，但这种形态学指标不如细胞或分子水平上的指标精确度高。

3.2 组织器官筛选法

主要是竞争性雌激素受体结合法(Competitive Estrogen Receptor Binding Assays)：具有雌激素效应的内分泌干扰物可以在特定器官内(如肝脏)与雌激素受体结合，启动信号传导途径，诱导产生细胞应答，并最终表现为卵黄原蛋白(vitellogenin，VTG)等终端产物的生成，既可以通过测量受体结合力，又可以通过监测终端产物的产量，较为灵敏地监测出待测物对生物体造成的内分泌干扰影响。美国环境保护局(EPA)已将雌激素受体结合法广泛应用于环境内分泌干扰物的前期快速筛选步骤中。

3.3 细胞筛选法

包括细胞培养检测法和酵母雌激素筛选测试法。前者除了能够通过特定器官内的细胞应答诱导生成生物标志物以外，具有雌激素效应的内分泌干扰物还可以对含有雌激素受体的人乳腺癌细胞系产生细胞应答[39]，这其中应用最广泛的即为MCF-7细胞增殖实验(MCF-7 cell proliferation bioassay)[40]；酵母雌激素筛选测试法则是利用特定生物标志物，如卵黄原蛋白等建立重组酵母筛选系统，将转基因酵母作为生物模型，利用受体-配体之间的相互作用进行内分泌干扰物的检测，该方法操作简便、耗时短、灵敏度极高，一般比MCF-7 细胞增殖实验和子宫增重方法高出2～5个数量级。

3.4 分子筛选法

主要是免疫检测法，其基本原理是生物分子(受体)与相应的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)结合，然后利用同位素、酶、荧光或化学发光底物等标记技术加以显示，根据生物分子被诱导产生的水平判断化学物质是否具有内分泌干扰特性[41]。免疫检测方法主要包括放射免疫分析法、酶免疫测定法、荧光免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法和化学发光免疫测定法，其中以酶联免疫法(EIA)和放射免疫法(RIA)最为常用。选取方便高效的生物标志物是各种免疫检测法中的关键所在，卵黄原蛋白是应用最早也是最为广泛的筛选类雌激素化合物的生物标志物，其中卵黄原蛋白的酶联免疫吸附方法最为方便，检出限可达2～6 ng·mL-1。此外，卵壳前体蛋白(choriogenin，CHG)也是鱼类中研究得较多的一种生物标志物。随着内分泌干扰分子机制研究的进展，芳香化酶mRNA、ERβ mRNA等越来越多的分子标志物被发现可用于内分泌干扰物质筛选[36]。

这4种研究水平的检测方法各有其优缺点：动物模型整体水平的检测法可以较为真实可靠地反映出兽药是否能够作为环境内分泌干扰物对生物体造成危害，但耗时耗材、精确度低；组织与器官水平的检测法较动物活体检测要方便，并能在一定程度上检测出某些需要经过体内代谢活化才会发挥性激素作用的化学物质；细胞检测法同样采用宏观指标，但更为快速、便捷，应用较广泛；分子检测法敏感度最高、耗时最短，可大大提高检测效率，并越来越多地向实践应用方向发展[36]。

3.5 实验动物选择原则

在干扰物筛选方法的应用中，选择的实验动物种类不但包括啮齿类和灵长类，还涉及到鱼类、鸟类和两栖类、爬行类等。模式生物的选取应遵循一定的原则：1)实验动物易于获得并易于在实验室培养；2)生长迅速，生活周期短；3)基础生物学研究比较深入，前期研究实验数据较丰富。不同实验动物靶标有着不同的优缺点，如现有的一些脊椎动物靶标，其中大鼠就有个体太大和饲养周期太长的缺点。就目前的研究现状和水平，国内实验室较易开展的兽药类内分泌干扰物筛选研究的模型生物有小型鱼类模型和两栖类模型，前者包括黑头软口鲦鱼(fathead minnow，Pimephales promelas)、日本青鳉(Japanese medaka，Oryzias latipes)和斑马鱼(zebrafish，Brachydanio rerio)。根据不同水平的评价体系，鱼类内分泌干扰效应的评价终点可见表2。两栖动物生活周期比较复杂，幼体生长速度快，食物链中具有水陆两栖的独特地位，卵、鳃和皮肤具有渗透性，能对污染物富积和放大，从而成为环境污染的前哨物种。目前适用于兽药类内分泌干扰物筛选的两栖模型动物种类有非洲爪蟾(Xenopus laevis)和热带爪蟾(Xenopus tropicalis)，具有广阔的应用前景。近年来，也有学者推荐家蚕可作为内分泌干扰效应的动物靶标[42]，可通过调查家蚕的性腺指数、性腺的组织病理学变化，产卵能力、子代孵化率、以及生殖发育关键基因的变化等指标，筛选可用于生殖毒性评价的生物标志物。但是，昆虫与哺乳动物在进化程度上有较大差异，将其内分泌干扰效应借鉴到哺乳动物甚至人类，还有待进一步研究。

目前关于兽药内分泌干扰效应的研究才刚刚起步，有关内分泌干扰物的筛选方法很多，并且日趋丰富，在今后的研究上应重点加深对干扰作用机制的研究。针对不同类型的兽药种类，根据其可能干扰内分泌系统的不同途径，选择合适的实验动物模型以及合适的筛选方式，并结合使用其他方法来辅助研究其潜在的内分泌干扰作用。

4 内分泌干扰物评价方法进展(Advances in the evaluation method of the endocrine disruptors)

发达国家从20世纪90年代以来，开始对内分泌干扰物进行研究，并相继发表了专题报告。OECD、美国、欧盟、日本等均建立了内分泌干扰物筛选检测的基本框架，并不断完善。目前，OECD内分泌分级筛选和检测框架草案已提出，美国一级筛选各试验的指导原则已完善，欧盟在建立优先名录上取得了不错的进展[43]。我国包括兽药在内的潜在内分泌干扰物的内分泌干扰效应的评价方法和筛选体系可参考美国EPA和OECD等发达国家和组织的经验建立。US EPA提出的内分泌干扰物筛选和检测的基本框架包括初级分类(Initial Sorting)、优先选择(Priority Setting)、一级筛选(Tier 1 Screening，T1S)、二级检测(Tier 2 Testing，T2T)[44]。欧盟对内分泌干扰物筛选的研究主要侧重于优先名录的确定[42]和内分泌干扰物对水生生物的研究[46]。欧盟于1999年制定了内分泌干扰物的策略包括短期、中期和长期措施。短期和中期的重点是为优先名录收集相关资料，以指导研究和监测，确定消费使用的具体情况和生态暴露情况。

OECD于2002年制定了内分泌干扰物检测与评价基本框架，并于2012年对其进行了修订[47]，包括5个层次评价，其中第一层次为利用化合物现有数据和非试验信息进行初筛，包括化合物的物理化学特性，从标准和非标准测试得到的所有可用(生态)毒理学数据；交叉参照、化学分类、定量-活性关系(QSARs)和其他电脑模拟预测，以及药物代谢性质(ADME)模型预测等。第二层次为体外测试，要求对提供特定内分泌作用机理/途径数据进行筛选，包括雌激素或雄激素受体结合试验、雌激素受体转录激活、雄激素或甲状腺激素转录激活、体外类固醇生成和MCF-7细胞增殖测试(ER拮抗剂/兴奋剂)等。

表2 鱼类内分泌干扰效应评价终点Table 2 Assessment endpoints of endocrine disruption effects on fish

第三层次为体内测试(哺乳类和非哺乳类方法)，对提供特定内分泌作用机理/途径数据进行筛选，其中哺乳类测试包括子宫增重法和赫什伯格法；非哺乳类测试包括爪蟾胚胎甲状腺激素信号通路测试、两栖动物变态测试、鱼类繁殖筛选测试等。第四层次也是利用更多体内测试(哺乳类和非哺乳类方法)，提供更加丰富的内分泌相关终点的有害效应数据。第五层次为体内测试(哺乳类和非哺乳类方法)，对提供大量生物体生命周期更多内分泌相关重点的有害效应数据进行判断，其中哺乳类测试包括一代延伸繁殖毒性测试和两代繁殖毒性测试；非哺乳类测试包括鱼类生命周期毒性测试(FLCTT)；青鳉多代测试(MMGT)；鸟类两代繁殖毒性测试和大型溞多代测试等。

我国尚未建立相关内分泌干扰物筛选和检测体系指导原则，因此包括兽药在内的潜在内分泌干扰物均无成熟的评价体系。截至目前为止，一般针对兽药的毒理学检测评价方法也只主要包括急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、致畸性和致癌性毒理学试验等，许多兽药具有内分泌干扰作用，用现有的毒理学评价方法标准有可能检测不到其潜在的毒性作用。国内开展兽药类内分泌干扰物的研究相对较晚，未来需要借鉴国际上已有的先进技术和经验，在国外研究评价的基础上，对国内可能有内分泌干扰效应的兽药进行全面研究，做出科学评价，并制定出符合我国国情的内分泌干扰物筛选和评价体系，进而应用在兽药类潜在内分泌干扰物的管理当中。

5 展望及建议(Prospects and suggestions)

1)虽然我国兽药污染现状及其潜在内分泌干扰风险已经引起相关管理部门和研究人员的重视，但必须注意的是，目前针对包括激素类兽药在内的具有潜在内分泌干扰性质的污染物的筛选研究还远远不够，且对不同种类动物的内分泌干扰作用机制的研究并不透彻，在今后的研究上应重点加深对干扰的作用机制的探讨；

2)需要借鉴国际上已有的先进技术和经验，建立起符合我国特点的兽药分泌干扰作用的评价体系，这需要开发灵敏高效的离体评价体系，并需要分别以不同的实验动物，包括鱼类、两栖类、鸟类及哺乳动物的活体评价模型，为潜在兽药类内分泌干扰物的危险控制提供可靠的实验方法和技术；

3)包括兽药在内的环境污染物常以低剂量复合形式存在，因此建立可靠的低剂量复合长期暴露的方法学，以便开展污染物对实验动物低剂量复合暴露下的内分泌干扰作用的研究。

[1] Colborn T, Clement C. Chemically-induced Alterations in Sexual and Functional Development—The Wildlife/Human Connection [M]. Princeton, N.J.: Princeton Scientific Pub Co, 1992: 403

[2] 安婧, 周启星. 药品及个人护理用品(PPCPs)的污染来源、环境残留及生态毒性[J]. 生态学杂志, 2009, 28(9): 1878-1890

An J, Zhou Q X. Pollution sources, environmental residues, and ecological toxicity of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs): A review [J]. Chinese Journal of Ecology, 2009, 28(9): 1878-1890 (in Chinese)

[3] 张志美, 郭时金, 张颖, 等. 兽药残留对环境的影响[J]. 动物医学进展, 2011, 32(8): 104-107

Zhang Z M, Guo S J, Zhang Y, et al. Advance in ecological environment impact of veterinary drug residues [J]. Progress in Veterinary Medicine, 2011, 32(8): 104-107 (in Chinese)

[4] 马驿, 孙永学, 陈进军, 等. 兽药残留对生态环境影响的研究进展[J]. 中国兽医科学, 2010, 40(6): 650-654

Ma Y, Sun Y X, Chen J J, et al. Advance in ecological environment impact of veterinary drug residues [J]. Chinese Veterinary Science, 2010, 40(6): 650-654 (in Chinese)

[5] 赵丹宇. 食品中激素类、抗生素类物质的残留污染及管理[J]. 中国食品卫生杂志, 2003, 15(1): 58-64

Zhao D Y. Contamination and control of hormone and antibiotic residues in foods [J]. Chinese Journal of Food Health, 2003, 15(1): 58-64 (in Chinese)

[6] 史熊杰, 刘春生, 余珂, 等. 环境内分泌干扰物毒理学研究[J]. 化学进展, 2009, 21(Z1): 340-349

Shi X J, Liu C S, Yu K, et al. Toxicological research on environmental endocrine disruptors [J]. Progress in Chemistry, 2009, 21(Z1): 340-349 (in Chinese)

[7] 张信连, 杨维东, 刘洁生. 环境内分泌干扰物对生物和人体健康的影响[J]. 国外医学: 临床生物化学与检验学分册, 2005, 26(6): 349-351

Zhang X L, Yang W D, Liu J S. Influence of environmental endocrine disruptors to organisisms and human health [J]. Foreign Medical Sciences (Section of Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine), 2005, 26(6): 349-351 (in Chinese)

[8] 解美娜, 张才乔, 曾卫东, 等. 环境内分泌干扰物对动物繁殖机能的干扰作用及其机制[J]. 中国兽医学报, 2004, 24(1): 101-103

Xie M N, Zhang C Q, Zeng W D, et al. Mechanisms of the disrupting effects of environmental endocrine disrupters on animal reproduction [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2004, 24(1): 101-103 (in Chinese)

[9] 刘菲, 蒲力力. 环境内分泌干扰物对男性生殖健康影响的研究进展[J]. 生殖医学杂志, 2006, 15(6): 425-428

Liu F, Pu L L. Research progress in effects of environmental endocrine disruptors on male reproductive health [J]. Journal of Reproductive Medicine, 2006, 15(6): 425-428 (in Chinese)

[10] Karci A, Balcioglu I A. Investigation of the tetracycline, sulfonamide, and fluoroquinolone antimicrobial compounds in animal manure and agricultural soils in Turkey [J]. Science of the Total Environment, 2009, 407(16): 4652-4664

[11] Watkinson A J, Murby E J, Kolpin D W, et al. The occurrence of antibiotics in an urban watershed: From wastewater to drinking water [J]. Science of the Total Environment, 2009, 407(8): 2711-2723

[12] 邰义萍. 珠三角地区蔬菜基地土壤中典型抗生素污染特征研究[D]. 广州: 暨南大学, 2010

Tai Y P. The study on pollution characteristics of typical antibiotics in soil from vegetable fields of Pearl Delta Area [D]. Guangzhou: Jinan University, 2010 (in Chinese)

[13] Gao L, Shi Y, Li W, et al. Occurrence of antibiotics in eight sewage treatment plants in Beijing, China [J]. Chemoshpere, 2012, 86(6): 665-671

[14] 孟磊, 杨兵, 薛南冬, 等. 氟喹诺酮类抗生素环境行为及其生态毒理研究进展[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 76-88

Meng L, Yang B, Xue N D, et al. A review on environmental behaviors and ecotoxicology of fluoroquinolone antibiotics [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 76-88 (in Chinese)

[15] 伍吉云, 万祎, 胡建英. 环境中内分泌干扰物的作用机制[J]. 环境与健康杂志, 2005, 22(6): 494-497

Wu J Y, Wan Y, Hu J Y. The action mechanism of environmental endocrine disruptors [J]. Journal of Environment and Health, 2005, 22(6): 494-497 (in Chinese)

[16] Lorenz F W. Fattening cockerels by stilbestrol administration [J]. Poultry Science, 1943, 22: 190

[17] Rumsey T S, Oltjen R R. Fate of radiocarbon in beef steers implanted with 14C-diethylstilbestrol [J]. Journal of Animal Science, 1975, 40: 550-560

[18] 黄芬, 叶绍辉, 龚振明. 己烯雌酚的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2007, 34(2): 51-54

Huang F, Ye S H, Gong Z M. The development of diethylstilbestrol [J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2007, 34(2): 51-54 (in Chinese)

[19] Mikkila T F, Toppari J, Paranko J. Effects of neonatal exposure to 4-tert-octylphenol, diethylstilbestrol, and flutamide on steroidogenesis in infantile rat testis [J]. Toxicological Sciences, 2006, 91(2): 456-466

[20] Shukuwa K, Izumi S, Hishikawa Y, et al. Diethylstilbestrol increases the density of prolactin cells in male mouse pituitary by inducing proliferation of prolactin cells and transdifferentiation of gonadotropic cells [J]. Histochemistry and Cell Biology, 2006, 126(1): 111-123

[21] 李俊锁, 邱月明, 王超. 兽药残留分析[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2002: 1

[22] 吴翠琴. 己烯雌酚和辛基酚对真鲷幼鱼的雌激素效应研究[J]. 水产科学, 2008, 27(12): 611-614

Wu C Q. Estrogenic effects of diethylstilbestrol and octylphenol on juvenile genuine porgy Pagrosomus major [J]. Fisheries Science, 2008, 27(12): 611-614 (in Chinese)

[23] 朱虹, 卫兰, 王文彦, 等. 己烯雌酚对小鼠脾细胞黄体生成素表达的影响[J]. 现代预防医学, 2008, 35(22): 4446-4449

Zhu H, Wei L, Wang W Y, et al. Effect of diethylstilbestrol on the expression of luteinizing hormone in cell of mice spleen [J].Modern Preventive Medicine, 2008, 35(22): 4446-4449 (in Chinese)

[24] 田兴贵, 李江森, 主性，等. 己烯雌酚对幼年香猪睾丸细胞的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(11): 1510-1514

Tian X G, Li J S, Zhu X, et al. The effects of DES on the testis cell of Xiang Pig [J]. Acta Veterinaria et Zootechnia Sinica, 2010, 41(11): 1510-1514 (in Chinese)

[25] 田兴贵, 李江森, 主性，等. 己烯雌酚对幼年香猪睾丸肥大细胞数量的影响[J]. 西南大学学报: 自然科学版, 2011, 33(8): 27-30

Tian X G, Li J S, Zhu X, et al. Effects of DES on the number of mast cells in the testis of immature Xiang Pig [J]. Journal of Southwest University: Natural Science Edition, 2011, 33(8): 27-30 (in Chinese)

[26] 叶盛群, 唐正义. 乙烯雌酚对泥鳅红细胞的诱导作用[J]. 内江师范学院学报, 2006, 21(6): 52-54

Ye S Q, Tang Z Y. Inductive effects of diethylstilbestrol in erythrocytes of Misgurnus anguillicadatus [J]. Journal of Neijang Teachers College, 2006, 21(6): 52-54 (in Chinese)

[27] Wollenberger L, Halling-Sørensen B, Kusk K O. Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna [J]. Chemosphere, 2000, 40(7): 723-730

[28] 李兆利, 陈海刚, 徐韵, 等. 3种兽药及饲料添加剂对鱼类的毒理效应[J]. 生态与农村环境学报, 2006, 22(1): 84-86

Li Z L, Chen H G, Xu Y, et al. Toxicological effects of three veterinary drugs and feed additives on fish [J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2006, 22(1): 84-86 (in Chinese)

[29] 何春鹏, 王恬, 刘文斌. 喹乙醇对草鱼肝细胞和胰腺外分泌部细胞的毒理研究[J]. 浙江大学学报: 农业与生命科学版, 2006, 32(6): 651-657

He C P, Wang T, Liu W B. Toxicological effect of olaquindox on liver cells and pancreas exocrine cells of Ctenopharyngodon idellus [J]. Journal of Zhejiang University: Agricutural & Life Science, 2006, 32(6): 651-657 (in Chinese)

[30] 尹荣焕, 白文林, 吴长德, 等. 喹乙醇对小鼠免疫器官及红细胞免疫功能的影响[J]. 安徽农业科学, 2007, 3(3): 717-718

Yin R H, Bai W L, Wu C D, et al. Effect of olaquindoxl on the immunity organ and red cell function of mouse [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2007, 3(3): 717-718 (in Chinese)

[31] Ryan-Borchers T A, Park J S, Chew B P, et al. Soy isoflavones modulate immune function in healthy postmenopausal women [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2006, 83(5): 1118-1125

[32] 戴述诚, 李志业, 叶勇, 等. 新型绿色饲料添加剂——大豆异黄酮[J]. 中国动物保健, 2013, 15(9): 15-18

Dai S C, Li Z Y, Ye Y, et al. A new green feed additive, soybean isoflavone. [J]. China Animal Health, 2013,15(9): 15-18 (in Chinese)

[33] Vandegehuchte M B, Lemiere F, Vanhaecke L, et al. Direct and transgenerational impact on Daphnia magna of chemicals with a known effect on DNA methylation [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2010, 151(3): 278-285

[34] Guerrero-Bosagna C, Settles M, Lucker B, et al. Epigenetic transgenerational actions of vinclozolin on promoter regions of the sperm epigenome [J]. PLoS One, 2010, 5(9): e13100

[35] Stromqvista M，Tooke N，Brunstrom B. DNA methylation levels in the 5' flanking region of the vitellogenin I gene in liver and brain of adult zebrafish (Danio rerio) —Sex and tissue differences and effects of 17 alpha-ethinylestradiol exposure [J]. Aquatic Toxicology, 2010, 98(3): 275-281

[36] 康亦珂, 汝少国, 王蔚. 环境内分泌干扰物快速筛选方法研究进展[J]. 科技导报, 2010, 28(12): 99-103

Kang Y K, Ru S G, Wang W. Progress in the rapid screening of endocrine disrupting chemicals[J]. Science and Technology Review, 2010, 28(12): 99-103 (in Chinese)

[37] Kang K S, Kim H S, Ryu D Y, et al. Immature uterotrophic assay is more sensitive than ovariectomized uterotrophic assay for the detection of estrogenicity of p-nonylphenol in Sprague -Dawleyrats [J]. Toxicology Letters, 2000, 118(1/2): 109-115

[38] Markey C M, Michaelson C L, Veson E C, et al. The mouse uterotrophic assay: A reevaluation of its validity in assessing the estrogenicity of bisphenol A [J]. Environmental Health Perspectives, 2001, 109(1): 55-60

[39] Korner W, Hanf V, Schuller W, et al. Development of a sensitive E-screen assay for quantitative analysis of estrogenic activity in municipal sewage plant effluents [J]. Science of the Total Environment, 1999, 225(1/2): 33-48

[40] Soto A M, Sonnenschein C. The role of estrogens on the proliferation of human breast tumor cells (MCF-7) [J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1985, 23(1): 87-94

[41] Estevez-Alberola M C, Marco M P. Immunochemical determination of xenobiotics with endocrine disrupting effects [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, 378(3): 563-575

[42] 沈卫锋, 孟智启, 蔡磊明. 家蚕——新的内分泌干扰物筛选靶标[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 154-158

Shen W F, Meng Z Q, Cai L M. Silkworm—A new target for endocrine disrupting chemicals screening [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 154-158 (in Chinese)

[43] 谭彦君, 李宁. 国内内外分泌干扰物筛选评价体系研究进展[J]. 卫生研究, 2011, 40(2): 270-272

Tang Y J, Li N. National and international progress in screening and assessment system of endocrine disrupters [J]. Journal of Hygiene Research, 2011, 40(2): 270-272 (in Chinese)

[44] US EPA. Endocrine disruptor screening program; chemical selection approach for initial round of screening, EPA-HQ-OPPT-2004-0109. [R]. Washington DC: US EPA, 2005

[45] European Commission. The commission staff working document on the implementation of the “Community Strategy for Endocrine Disrupters“—A range of substances suspected of interfering with the hormone systems of humans and wildlife (COM (1999) 706), (COM (2001) 262) and (SEC (2004) 1372), SEC (2007) 1635 [R]. Brussels: European Commission, 2007

[46] REACH. Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment Chapter R. 7b: Endpoint Specific Guidance [R]. Helsinki: European Chemicals Agency, 2008

[47] OECD. OECD conceptual framework for the testing and assessment of endocrine disrupting chemicals.Guidance Document 150 (Annex 1.4) [R]. Paris: OECD, 2012