陇马陆配伍中药抑制幽门螺杆菌作用的实验研究

2017-03-14赵曰超王礼徐媛媛

中国医学创新 2017年4期

赵曰超　王礼　徐媛媛

【摘要】目的：探討陇马陆分别与红芪、黄连、红景天、马齿苋、蒲公英配伍后的抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）作用以及药物间是否有协同效应。方法：采用水提法和醇提法提取上述药物配方及陇马陆、红景天和黄连单药的有效成分，应用纸片琼脂扩散法筛选上述配方对Hp的抑制作用；建立Hp液体培养模型，采用稀释法测定陇马陆、黄连、红景天单药及复方提取物的抗Hp最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），并比较药物间配伍后的协同效应。结果：陇马陆与红芪、红景天、黄连、马齿苋、蒲公英药配伍后对Hp均有抑制作用，以与黄连配伍后抑制作用最强；陇马陆、黄连、红景天、陇马陆-黄连、陇马陆-红景天对Hp的MIC分别为20～40、0.63～1.25、1.25～2.50、1.25～2.50、10～20 mg/mL；与陇马陆配伍后，黄连和红景天的抗Hp MIC仅为单药的1/2倍。结论：陇马陆分别与红芪、红景天、黄连、马齿苋、蒲公英配伍对Hp均有一定的抑菌作用；陇马陆与黄连、红景天配伍后可产生抗Hp的协同效应；Hp液体培养稀释法可以有效判断中药的抗Hp效能。

【关键词】陇马陆；黄连；红景天；幽门螺杆菌；最小抑菌浓度；协同效应

【Abstract】 Objective：To study the bacteriostasis against Helicobacter pylori（Hp） of the compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Olerace，Taraxacum Mongolicum respectively and the synergies among these Chinese Medicines.Method：The effective ingredients of the several Kronopolites Svenhedini compounds and the single drug of Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea were extracted by water decoction extraction and ethanol extraction respectively.The bacteriostasis of the mentioned compounds against Hp were screened by disc agar diffusion.The liquid model for Hp culturing was established.Minimum inhibitory concentration（MIC） of the Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea and the formulations mentioned above against Hp were mearsured by serial dilution method and the synergies between two drugs of the compounds were compared.Result：The compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum Polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Olerace，Taraxacum Mongolicum respectively all exhibited bacteriostasis against Hp and the most powerful compound among them was Kronopolites Svenhedini accompanied with Rhizoma Coptidis.MIC of Kronopolites Svenhedini，Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea，Kronopolites Svenhedini-rhizoma Coptidis，Kronopolites Svenhedini-rhodiola Rosea were respectively 20-40，0.63-1.25，1.25-2.50，10.00-20.00 mg/mL.When combined with Kronopolites Svenhedini，MIC against Hp of Rhizoma Coptidis，Rhodiola Rosea were half lower than those of the single herbs.Conclusion：Compounds of Kronopolites Svenhedini with Hedysarum Polybotrys，Rhodiola Rosea，Rhizoma Coptidis，Portulaca Oleracea，Taraxacum Mongolicum respectively all have bacteriostasis against Hp.Kronopolites Svenhedini companied with Rhizoma Coptidis or Rhodiola Rosea can produce synergy when they are used to eliminate Hp.Hp liquid culture dilution method can effectively determine the anti-Hp potency of traditional Chinese medicine.

【Key words】 Kronopolites Svenhedini； Rhizoma Coptidis； Rhodiola Rosea； Helicobacter pylori； Minimum inhibitory concentration； Synergy

First-authors address：The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China；Department of Pathogenic Biology of Lanzhou University Lanzhou 730000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.011

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是引发胃炎和消化性溃疡的主要致病因素，而且与胃恶性肿瘤的发生密切相关[1]。Hp在人群中的感染率很高，我国人群Hp的现症感染率为42%～64%[2]。第四次全国Hp感染处理共识报告指出，Hp阳性的消化性溃疡（不论是否活动和有无并发症史）与胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）强烈推荐根除Hp[3]。有研究表明，在根除Hp的治疗中，使用含克拉霉素的三联疗法的根除率为78.3%，使用含铋剂的四联疗法的根除率为77.0%[4]，并且耐药率呈现上升趋势[5]。亟待寻找新的有效根除Hp的药物以应对Hp的耐药。

中药在治疗慢性胃炎和消化性溃疡中的疗效早已确认。陇马陆[Kronopolites Svenhedini（Verhoeff）]为甘肃省道地药材，具有利湿止痛、和中开胃的功效[6]，陇马陆胃药片治疗胃溃疡效果显著[7]，动物实验证明有抑制胃酸及保护胃黏膜的作用[8-9]。中药在临床上往往以复方的形式使用，药物间的协同作用在治疗中发挥重要作用。本文通过筛选陇马陆分别与红芪、红景天、黄连、马齿苋、蒲公英配伍后对Hp的抑制作用后，将陇马陆与黄连或红景天进行单药及复方抗Hp最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定，准确判断上述中药的抗Hp作用效能及药物间的协同作用，为开发抗Hp中药、中药临床抗Hp治疗提供理论支持，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 Hp J99，来源于兰州大学菌种保藏中心。

1.1.2 实验用中药材陇马陆（产地甘肃），红芪（产地甘肃），红景天（产地西藏），黄连（产地四川），马齿苋（产地安徽），蒲公英（产地甘肃）。陇马陆购自兰州大学第二医院药房，红芪、红景天、黄连、蒲公英均购自兰州百宝药业有限公司。

1.1.3 主要仪器与试剂 HERAcell?240iCO2培养箱（Thermo）；生物安全柜（HFsafe-1200）；水平摇床（IKA-KS260）；调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；旋转蒸发仪（BUCHI）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（郑州英峪予华仪器有限公司）；快速混勻器（常州国华电器有限公司）；高速冷冻离心机（Thermo BIOFUGE STRATOS）；紫外分光光度计（Thermo Scientific BioMate 3S）；手提式多功能粉碎机（上海长沙工贸有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；-80 ℃冰箱（Thermo）；电子天平（Sartorius）。Hp快速尿素酶诊断试剂盒（福建三强）；羊血（南京便诊）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；哥伦比亚琼脂（BD）；脑心浸液（BD）；革兰染色液（海博生物）。

1.2 方法

1.2.1 中药配伍以陇马陆为基础药物，依据临床用中药量，分别按如下比例进行药物配伍，陇马陆与红芪2∶3，陇马陆与红景天1∶1，陇马陆与黄连1∶1，陇马陆与马齿苋1∶2，陇马陆与蒲公英1∶2。

1.2.2 中药提取与浓缩采用水提法和醇提法提取中药的有效成分。（1）水提法：采用加热回流法提取。将每味中药使用粉碎机粉碎后，按照前述配伍原则进行混合，称取每个配方药物混合物5 g，加入40 mL超纯水，浸泡约12 h后使用回流法加热1 h，离心后取上清，向药渣中再加入40 mL超纯水，再次回流法加热1 h，离心后取上清，合并两次药液，蒸发浓缩后用超纯水定容至25 mL，使每毫升液体含生药0.2 g。单味药物的水提法提取同前。（2）醇提法：采用超声萃取法。将每味中药使用粉碎机粉碎，同前按比例进行混合，称取配方药物混合物5 g，加入75%酒精40 mL，浸泡约12 h后置超声波清洗器中（25 ℃，80 W）1 h，使用循环水真空泵抽滤，去除药渣，将药液蒸发浓缩，超纯水定容至10 mL，使每毫升药液含生药0.5 g。

1.2.3 中药的灭菌水提物使用0.22 μm滤器除菌；醇提物采用100 ℃，加热1 h除菌后，吸取少量醇提物加入营养肉汤中，振荡培养48 h后观察灭菌效果，以培养液清亮为灭菌。

1.2.4 培养基制备（1）Hp固体平板培养基：称取4.25 g哥伦比亚琼脂（BD），溶于100 mL超纯水中，高压灭菌后，加入10%葡萄糖5 mL及无菌脱纤维绵羊血7 mL，混匀后倒入无菌平皿，凝固后使用封口膜封口，置4 ℃冰箱备用。（2）Hp液体培养基：称取3.7 g脑心浸液干粉（BD），溶于100 mL超纯水中，高压灭菌后，加入10%葡萄糖5 mL及灭活的新生牛血清10 mL，混匀后置4 ℃冰箱备用。

1.2.5 Hp复苏、鉴定和液体培养将-80 ℃冻存Hp J99分区划线接种Hp固体平板培养基上，置三气培养箱中（10%CO2，5%O2，85%N2）37 ℃培养3 d。经Hp快速尿素酶试验和革兰染色形态观察鉴定后，挑取单菌落接种至Hp液体培养基，置三气培养箱中，37 ℃，振荡（100 转/min）培养。

1.2.6 纸片琼脂扩散法筛选有抑制Hp作用的中药配伍将液体培养48 h的Hp均匀涂布于Hp固体平板培养基表面后，将直径6 mm的无菌滤纸片贴至平板表面。吸取已提取药液10 μL滴至纸片中央，同时设置未加药的空白纸片对照，平板加样后置三气培养箱中37 ℃培养72 h，测量抑菌圈直径大小。

1.2.7 有抑菌作用中药对Hp的MIC测定将1.2.6筛选出的有一定抑菌作用的配方及单味药提取物进行MIC测定。配置Hp液体培养基，按照倍比稀释法将药物浓度逐层稀释同时设不含药的空白培养基作对照。由于药液自身颜色等因素的影响，同一药物浓度梯度设置接种Hp及不接种Hp的对照（以陇马陆MIC测定为例，见表1）。将培养至稳定期的Hp菌液1∶100接种至培养基中，使Hp初始浓度控制在106～107 cfu/mL范围，将接种Hp后的培养基放入三气培养箱中37 ℃振荡培养48 h，以未接种Hp含药对应浓度培养基调零后，测定同一药物浓度梯度接种Hp后培养液的光密度（optical density，OD）600值，若OD值变化明显，则证明有Hp生长。以此来判断药物干预Hp的MIC。

1.2.8 陇马陆与黄连素或红景天的抗Hp协同作用测定向液体培养基中加入低于MIC浓度的陇马陆水提物，测在此条件干预下的黄连、红景天水提物对Hp的MIC范围（以陇马陆与黄连协同性测定为例，见表2）。测定方法如1.2.7中所述。

2 结果

2.1 陇马陆配伍不同中药抑制Hp作用的初筛结果陇马陆与以上5种中药配伍，经过水煎提取或醇提取后提取物均显示出对Hp抑菌效果（陇马陆与红景天醇提取物对抑菌圈结果有干扰）。为进一步明确上述中药的抑制Hp作用及抑菌效力，进行了陇马陆、黄连、红景天单药及不同配伍的抑制Hp MIC测定。见表3。

2.2 陇马陆、黄连、红景天单药及配伍水提物对Hp的MIC测定无论陇马陆、黄连、红景天单药还是陇马陆与黄连或红景天的配伍水提物，均对Hp有一定抑制作用，且以黄连提取物的抑菌效力最好，见表4。

2.3 陇马陆配伍黄连素或红景天的抑制Hp的协同作用测定在含有抗Hp1/2MIC浓度的陇马陆液体培养基中，黄连水提物、红景天水提取物对Hp的MIC均低于空白液体培养基中对Hp的MIC，表明陇马陆和黄连素或红景天配伍抗Hp均具有协同作用，见表5。

3 讨论

幽门螺杆菌（Helicobacter pylow，Hp）感染是引发上消化道疾病的重要原因，根除Hp已成为治疗慢性胃炎、消化性溃疡的重要措施。目前根除Hp方案中所用抗生素许多易产生耐药性。许多中药具有广谱的抗菌成分，从中药中可以发掘抗Hp的药物，不同中药的配伍使用是中药临床用药的重要特征。在本次研究中，使用了两味药物的联合配伍筛选抗Hp作用，两味中药的配伍易于探明不同中药的抗Hp作用，同时兼顾药物复方的特点。临床实践已经证明，陇马陆分别与红芪、红景天、黄连、马齿苋、蒲公英适量配伍可用于治疗胃炎及消化性溃疡。本文的研究发现，陇马陆分别与红芪、黄连、马齿苋、蒲公英适量配伍后的水提取物和醇提取物，陇马陆与红景天的水提取物均显示出一定的抗Hp活性，上述結果间接验证陇马陆与相应中药配伍治疗胃部疾病可能与清除Hp感染相关。

陇马陆是一味常见动物药，其中的成分苦杏仁味苯甲醛具有广谱的抗菌作用[6]，提取出的壳聚糖对部分革兰阳性和革兰阴性细菌有着不同程度的抑菌作用[10]。有研究表明，由陇马陆中提取的陇马陆素或者壳聚糖对Hp有抑制作用[11-12]。红芪归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓以及敛疮生肌等功能[13]，有抗炎、抗病毒作用[14]，有关抗菌方面的功能研究较少，其同科不同属的黄芪具有一定的抑菌作用[15]。本实验发现陇马陆与红芪配伍后对Hp有一定的抑制作用，可为Hp感染相关性疾病的治疗提供参考。红景天在某些方剂中作为清热、滋补元气的功效使用[16]，现代药理学研究其具有抗氧化[17]、抗病毒的作用[18]，其脂溶性成分对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、白假丝酵母菌等具有良好的抑菌杀菌作用[19]，且副作用较小，于1991年被卫生部批准为新食品资源[20]。本研究发现红景天对Hp也有较强的抑杀作用。黄连具有清热解毒、燥湿杀虫等功效，蒲公英具有清热解毒，消肿散结，清利湿热的功效[21]，两者均归胃经[22]，有实验证实均有广谱抑菌效果，黄连对革兰阳性球菌及肠道菌的抑菌作用较强[23]，蒲公英有效抑制炎症作用的成分可能为黄酮类、多糖类以及酚酸类物质[24]。有方剂含黄连、蒲公英等治疗Hp感染患者有效[25]。本实验从体外实验角度证实黄连、蒲公英与陇马陆配伍后均有抑制Hp的作用，尤其黄连的抑菌效果明显。马齿苋具有清热解毒、凉血止血的功效，用于治疗热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒等[26]，其含有的黄酮类物质对热稳定[27]，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、酵母菌等均有较好的抑制效果[28]。有动物实验表明，马齿苋通过抑制胃蛋白酶活性、减少胃酸分泌等因素来起到抗胃溃疡的作用[29]。本实验表明其与陇马陆配伍后也有抗Hp的作用，可能也是促进胃溃疡治愈的机制之一。

为进一步探讨陇马陆、黄连、红景天单药及配伍后复方的抗菌效能，本文采用了稀释法测定了三种药物单药及配伍后对Hp的MIC。Hp为微需氧菌，液体培养难度较大，本文在建立了Hp在液体培养基中良好的生长条件后，采用国际上常用抗菌药物MIC测定的稀释法，评价了目的药物的抗Hp效能，进一步证明三种药物单药及其不同的配伍均具有一定的抗Hp作用。同时本实验所用方法为今后筛选和鉴定中药抗Hp的效能提供了参考依据。

配伍药物之间可在药代动力学效应及药效动力学效应的影响下[30]，实现比单药使用时更优的功效或者更低的副作用。本文的实验证实，在含有低于抗Hp1/2MIC的陇马陆液体培养基中，黄连或红景天单药的抗Hp效能显著增加，表现为MIC明显低于在Hp空白液体培养基中抗Hp的MIC，表明陇马陆与黄连及陇马陆与红景天之间在抑制Hp时有一定的协同效应。

综上所述，陇马陆分别与红芪、红景天、黄连、马齿苋、蒲公英配伍对Hp均有一定的抑菌作用；陇马陆与黄连、红景天之间存在抗Hp的协同效应。中药治疗胃炎、消化性溃疡机制复杂，本研究通过对Hp的抑制作用方面为临床用药提供了一定的理论基础。

致谢：衷心感谢兰州大学第二医院中西医结合科的刘宝厚教授提供的中药配伍方剂。

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