滇桂艾纳香多糖的分离纯化及单糖组成分析

许子竞+刘茜

摘要以滇桂艾纳香干燥全草为原料，以水为溶剂提取多糖BRP，经过D101大孔树脂脱色，DEAE纤维素柱分离，依次用水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，得BRP0，BRP1.5，BRP3和BRP4四个洗脱部分；将BRP0，BRP1.5采用Sevage法脱蛋白、活水透析和Sephadex G15柱层析，再经琼脂糖Sepharose 6FF柱层析分离纯化，得到BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五个组份；GPC检测其相对分子质量、分子质量分布及峰型，确定它们为均一组分多糖；HPLC分析结果显示，BRP0和BRP1.5主要由鼠李糖、果糖和半乳糖组成，其物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

关键词滇桂艾纳香多糖；DEAE纤维素分离；凝胶色谱纯化；HPGPC检测；单糖分析

中图分类号R284文献标识码A文章编号10002537（2017）01006506

滇桂艾纳香（Blumea riparia （BL.） DC）为菊科艾纳香属植物的干燥全草，又名假东风草，多见于云南和广西交接部，生于山草坡地或灌木丛中[1]，其味甘、温、无毒，具有活血散瘀、祛風除湿、利水作用，在广西民间有几百年的药用历史，常用于妇女经期提前、产后血崩、浮肿、骨痛、受凉腹痛、腹泻等多种妇科常见疾病的防治[2].以滇桂艾纳香为原料的乙醇溶液提取物制成的中成药——妇血康颗粒，已用于临床，疗效显著；研究表明，其水提取物也具有显著的止血活性功效[34]，但是其有效成分及其含量、药理作用均不是非常明确；因此，本文对其水提多糖（Blumea riparia Polysaccharides， abbreviated as BRP）成分进行提纯，并对多糖的组分进行分析[56]，为进一步研究妇血康颗粒制剂的药理和作用机制打下基础.

1仪器与方法

1.1材料与设备

滇桂艾纳香干燥全草，广西桂西制药有限公司；DEAE纤维素，上海恒信化学试剂有限公司；Sephadex G15和Sepharose 6FF 生化试剂，南京森贝伽生物科技公司；葡萄糖（AR），上海医药公司；果糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸（生化试剂），上海伯奥生物科技有限公司；RC451k透析袋，上海绿岛科技发展有公司；硫酸、苯酚、无水乙醇、丙酮等均为国产AR试剂.

Nexus 470型FTIR红外分光光谱仪（Nicole，America）；Agilent 1260高效液相色谱仪（America）；Agilent Technotgies 1200 GPC System（America）；UV265FW紫外可见分光光度计（Shimadzu Japan）；DZF6020真空干燥箱（河南巩义科技仪器公司）；ALPHAL型真空冷冻干燥机（Germany）.

1.2实验方法

1.2.1滇桂艾纳香干燥全草多糖BRP的提取、分离、纯化

（1） 提取取滇桂艾纳香干燥全草5 kg，粉碎，过282 μm筛，称其碎片3.0 kg，加无水乙醇回流提取多次，除去脂溶性成分，药渣以蒸馏水为溶剂，用微波提取器（1 kW，10 L）在85 ℃下提取3次，每次20 min；提取液离心去杂、减压浓缩约至原体积的1/5，加乙醇至含醇80%左右，冰浴放置过夜，离心，得BRP沉淀物.BRP用无水乙醇多次浸提，去除残余脂溶性物质和部分色素.

（2） 脱色将上述BRP配成稀水溶液，直至沉淀物不再溶解，过滤，取滤液过D101大孔树脂，用水洗脱，直至洗脱液颜色浅淡，收集水洗脱液，浓缩[7].

（3） 分离将上述浓缩液进行DEAE纤维素柱层析[89]，依次用蒸馏水和0.15，0.30，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，用苯酚硫酸显色检测，收集各梯度洗脱液.

（4） 脱蛋白对各收集液采用Sevage法（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1）多次脱蛋白至紫外260～280 nm处无明显吸收峰为止[10].

（5） 透析脱蛋白后的BRP溶液装入GRC451k透析袋内，活水透析72 h以上.

（6） 脱盐透析后的BRP溶液过Sephadex G15柱层析，脱除BRP溶液中残留的盐，收集BRP溶液.

（7） 凝胶纯化将透析的BRP0和BRP1.5溶液浓缩，过0.45 μm微孔滤膜，经琼脂糖凝胶Sepharose 6FF层析，蒸馏水洗脱，自动部分收集器收集，苯酚硫酸显色检测，绘制洗脱曲线，根据峰型合并各洗脱部分，冷冻干燥，得BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五个组分.

1.2.2BRP性质表征

（1） BRP相对分子质量及分子质量分布测定采用凝胶渗透色谱法，Agilent 1260HPLC仪，柱型为PL.AqnagelOH（300 mm×7.8 mm），柱温，35 ℃；流动相：0.05 mol/L H3PO4Na2HPO4缓冲液（pH6.7，加0.05%NaN3）；流速：1.0 mL/min；示差折光检测，进样体积20 μL；以T系列葡聚糖T1，T3，T5，T7，T9，T11和T13为标样对照.

（2） BRP的酸水解分别取50 mg BRP01和BRP1.5置于安培管中， 加入6 mL 2 mol/L H2SO4，在油浴中保持110 ℃恒温加热8 h，水解液用BaCO3粉末中和除酸，离心，将上清液浓缩，定容至2 mL，供HPLC分析.

（3） BRP红外光谱分析取微量BRP样品，拌KBr研磨压片，在4 000～400 cm-1波数范围内扫描检测基团吸收峰类型.

（4） BRP单糖组成分析色谱条件：Kromasil NH2色谱柱（250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈水（体积比为80∶20）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min，示差折光检测；进样量：20 μL[1112].

2结果与分析

2.1BRP蛋白含量检测

BRP经紫外光谱扫描检测， 如图1所示，260～280 nm处几乎无紫外吸收峰，表明多糖中蛋白、多肽及核酸几乎脱除完全，达到分离纯化要求.

2.2DEAE纤维素对BRP的分离

BRP溶液经DEAE纤维素层析柱分离，分别用蒸馏水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集部分分别命名BRP0，BRP1.5，BRP3和BRP4.5，其洗脱曲线见图2.由于BRP3和BRP4.5组分还含少量难除色素，所以只对BRP0和BRP1.5进一步分离纯化研究.

2.3BRP0进一步纯化

将BRP0配成适当浓度溶液，经琼脂糖凝胶Sepharose 6FF柱层析纯化分离，蒸馏水洗脱，BRP0的洗脱曲线如图3所示，所得多糖命名BRP01.

2.4BRP1.5进一步纯化

将BRP1.5上Sepharose 6 FF层析洗脱，得4个洗脱组分，分别命名为BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54，洗脱曲线如图4所示.

2.5BRP纯化组分分子量及分子量分布测定

采用凝胶渗透色谱法（GPC 法）测定多糖BRP的相對分子质量（M）[13]，BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54各组分分子质量及分子质量分布测定和纯度如图5～6所示.

由表1可见，多糖组分BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54的重均相对分子质量分别为1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系数分别为1.035，1.053，1.099，1.091和1081，这些组分均由单一色谱峰组成，峰型尖锐均匀对称，表明它们是均一组分多糖.

2.6BRP的红外光谱图

BRP红外光谱各吸收峰如图7所示，其对应基团振动类型如表2，从表2可知，波数1 616.82 cm-1处是〖KG-*2〗〖JG（〗C〖ZJLX，Y〗O〖JG）〗〖KG-1*2〗伸缩振动吸收峰，表明多糖BRP含有醛糖酸[14].

2.7BRP1.5的HPLC分析

HPLC对水解后的BRP多糖与单糖对照品对照，分析其单糖组成[15]，见图8～9所示.结果表明，BRP0和BRP1.5除含少量半乳糖醛酸外，主要由鼠李糖、果糖和半乳糖组成，其物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

3结论

滇桂艾纳香干燥全草提取得粗多糖BRP，经DEAE纤维素层析分离得到BRP0，BRP1.5，BRP3和 BRP4.5，进一步将BRP0和BRP1.5纯化后获得BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54组分，经HPGPC检测，它们为均一分子多糖，其重均相对分子质量分别为1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系数分别为1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，说明其分子质量分布均一.通过HPLC分析，BRP0和BRP1.5主要由鼠李糖、果糖、半乳糖组成， 其单糖物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

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