肺结核患者外周血单个核细胞中lncRNA NEAT1的检测及临床意义

姚芳苡，黄自坤，熊国亮，彭亦平，李俊明，傅颖媛

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西南昌330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006；3、江西省胸科医院检验科，江西南昌330006；4、江西省胸科医院内二科，江西南昌330006)

·论著·

肺结核患者外周血单个核细胞中lncRNA NEAT1的检测及临床意义

姚芳苡1，黄自坤2，熊国亮3，彭亦平4，李俊明2，傅颖媛1

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西南昌330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006；3、江西省胸科医院检验科，江西南昌330006；4、江西省胸科医院内二科，江西南昌330006)

目的探讨肺结核患者外周血单个核细胞（PBMC）中长链非编码RNA（lncRNA）核富含丰富的转录本1（NEAT1）的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR（RT－PCR）技术检测65例肺结核病患者（结核组）及30例健康体检者（健康对照组）PBMC中lncRNA NEAT1的表达量，分析其与结核病发生发展以及转归的相关性。结果RT－PCR检测结果显示lncRNA NEAT1在肺结核患者PBMC中的相对表达水平是健康对照组的4.90±0.72倍，差异有统计学意义(P＜0.01)。LncRNA NEAT1在初治和复治病例中表达差异无统计学意义（P＞0.05）；lncRNA NEAT1在肺部有无空洞及空洞数量分组之间表达差异有统计学意义（P＜0.05），即lncRNA NEAT1随空洞累及范围的增加而升高。肺结核患者PBMC中lncRNA NEAT1表达量随着治疗时间逐渐下降，恢复至正常水平。结论肺结核患者PBMC中lncRNA NEAT1表达升高，且与肺结核的发展和转归有关，监测PBMC中lncRNA NEAT1表达或可以评估结核病患者预后情况。

结核病；LncRNA NEAT1；预后

结核病是严重危害人类健康的慢性感染性疾病。近年来由于耐药菌株的不断增多，治疗难度越来越大，广泛耐药结核病的出现给抗痨治疗提出新的挑战[1]。长期的流行病学研究显示，虽然结核菌感染人数众多，但只有5%～10%的感染者发展为活动性结核病，机体的免疫系统在结核病的发病和发展中起了关键作用[2，3]。抗结核免疫主要依赖细胞免疫，但到目前为止，对结核免疫逃逸机制的了解还非常有限，这也是结核病难以有效控制的重要原因之一。

长链非编码RNA（long non－coding RNA，lncR-NA)是一类长度超过200核苷酸的RNA分子，广泛表达于真核生物体内，参与细胞增殖、分化、凋亡、发育等众多的生物学进程[4，5]。lncRNA NEAT1（核富含丰富的转录本1，nuclear enriched abundant transcript 1）是在细胞核内表达的一个lncRNA，它可与蛋白NONO相互作用，促进了核内旁斑的形成[6，7]。近期研究发现，lncRNA NEAT1作为一种新的调控分子在免疫调节过程中发挥重要作用[8]。目前lncRNA在结核病中的研究尚处于在起步阶段，有关lncRNA NEAT1在结核病患者中的表达情况尚不清楚。本研究通过实时荧光定量PCR（real－time quantitative PCR，RT－PCR）技术检测肺结核患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中lncRNA NEAT1的表达，观察治疗中以及治疗后患者lncRNA NEAT1的表达变化，探讨其在结核病发病过程中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 病例资料⑴结核组：收集2014年5月至2015年5月于江西省胸科医院结核科住院的结核病患者65例，其中男35例，女30例；年龄22～58岁，中位年龄34岁；初治40例，复治25例。所有肺结核患者均依据临床表现、细菌学、影像学或抗结核药物治疗明确诊断者，并经结核分枝杆菌基因分型为结核分枝杆菌。诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册（结核病分册）》诊断标准。⑵健康对照组：收集同期于江西省南昌大学第一附属医院保健科体检者30例，其中男17例，女13例；年龄25～60岁，中位年龄36岁。胸部X透视检查未见异常，近期无接触结核病史者，经PPD皮试结果为阴性。所有对象均排除合并肿瘤、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物的患者；排除孕妇或哺乳期妇女；排除HBV、HCV、HIV感染者或（和）AIDS患者。本研究经医学伦理学委员会批准，患者知情同意。结核组及健康对照组2组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 试剂与设备

1.2.1 主要试剂Ficoll淋巴细胞分离液购自美国sigma公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBRPremix Ex TaqTM均购自大连宝生物TaKaRa公司。

1.2.2 仪器分光光度仪购自美国Bio－Rad公司；Applied Biosystems 7600型荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 标本收集及处理清晨空腹采集研究对象静脉血5ml于肝素钠抗凝管中，混匀备用。按常规方法用Ficoll淋巴细胞分离液提取PBMC。

1.3.2 总RNA提取按Trizol试剂说明书提取PBMC总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。采用分光光度仪检测总RNA浓度和质量，检测合格后于－80℃冻存待用。

1.3.3 反转录法反应以GAPDH作为内参照，分析lncRNA NEAT1的表达。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录成互补脱氧核糖核酸。逆转录产物于－80℃冻存待用。

1.3.3 RT－PCR反应采用SYBR法进行RT－PCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。引物由本实验室设计，由上海生工生物工程有限公司合成：lncRNA NEAT1上游引物为：5'－CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC－3'，下游引物为5'－CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC－3'；内参GAPDH上游引物为5'－GCACCGTCAAGG CTGAGAAC－3'，下游引物为5'－TGGTGAAGACGC CAGTGGA－3'。以20μl反应体系进行检测。反应体系为：1×SYBR Green I master－mix、0.5μmol/L特异前向引物、0.5μmol/L特异反向引物、1μl反转录产物。反应条件为：预变性95℃10min，95℃15s，60℃1min，72℃30s，40循环。RT－PCR使用ABI 7600仪器进行。所有样品做3复孔。根据待测标本的Ct值，以GAPDH为内参照，采用相对定量法对RTPCR结果进行分析，以2－△△Ct表示肺结核患者PBMC中目的基因的表达相对与健康对照组的变化倍数。

1.4 统计学处理实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，结果以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较用t检验，多组间的比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结核患者和健康对照者PBMC中lncRNA NEAT1表达水平比较采用RT－PCR技术检测65例肺结核患者和30例健康对照者PBMC中lncRNA NEAT1的表达差异。检测结果显示如图1，肺结核组PBMC中的lncRNA NEAT1水平显著高于对照组，为正常水平的4.90±0.72倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 肺结核患者PBMC中lncRNANEAT1的相对表达量

2.2 不同肺结核组PBMC中lncRNA NEAT1表达水平比较根据肺结核患者既往抗结核治疗的有无分为初治病例和复治病例，对上述患者PBMC中lncRNA NEAT1表达水平分析发现，初治和复治病例lncRNA NEAT1表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图2A。根据肺结核患者肺部空洞的有无及空洞所占肺野数分为无空洞组、空洞1~2个肺野组、空洞3~4个肺野组以及空洞5~6个肺野组，结果显示，随着肺部空洞的增加，PBMC中lncRNA NEAT1表达量逐渐升高（P＜0.05），见图2B。

图2 不同肺结核组PBMC中lncRNANEAT1的相对表达量

2.3 肺结核患者PBMC中lncRNA NEAT1随着抗结核治疗时间的变化情况为了检测lncRNA NEAT1在疾病治疗过程中的动态变化能否反映抗结核治疗的效果，我们对已收治的20例初治结核患者进行6个月的随访，并按不同治疗时间给予分组，比较分析了新发病例在未接受治疗组、接受治疗3月组和接受治疗6月组3组间PBMC中lncRNA NEAT1的变化情况，结果显示如图3，随着治疗时间延长，lncRNA NEAT1表达量逐渐降低。与未接受治疗组比较，接受治疗3月组和6月组lncRNA NEAT1水平均显著降低（P＜0.05）；接受治疗6月组lncRNA NEAT1水平接近健康对照组水平，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 抗结核治疗过程中lncRNANEAT1相对表达量的变化

3 讨论

目前越来越多的证据表明，lncRNA在多种人类疾病的发生、发展中均扮演着极其重要的角色[9]。近年，lncRNA在结核病发生发展过程中的调控作用也开始引起人们的关注[10]。如Yi等[11]采用基因芯片技术检测了外周血CD4+T细胞，发现在活动性肺结核患者、潜伏性结核感染者和健康对照者中，lncRNA有异常表达。最近有学者证实，T细胞抑制分子CD244通过诱导lncRNA CD244的表达，从表观遗传上控制了结核菌感染过程中CD8+T细胞的免疫反应[12]。我们近期研究证实，lncRNA肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在结核感染过程中表达升高，且与结核的发展和转归有关，下调MALAT1表达可增强巨噬细胞对胞内结核菌的清除能力[13]。

NEAT1是位于细胞核内一种称为旁斑的结构上，对该结构的形成和维持至关重要。随着对lncRNA NEAT1研究的深入，研究人员发现lncRNA NEAT1是一个长的多聚腺苷酸RNA转录本，且已有的研究证实，lncRNA NEAT1上调表达与恶性肿瘤的发生发展有着密切关系[14，15]。近期的研究证实，lncRNA NEAT1还参与了免疫调控，在固有免疫应答中发挥重要调控作用。如，Zhang Q等[16]研究发现HIV-1感染可以提高lncRNA NEAT1的表达水平，高表达的lncRNA NEAT1可以调控未经剪切的HIV-1转录本的转录后修饰。张飞飞等[17]发现lncRNA NEAT1参与了Toll样受体2（tolllike receptors 2，TLR2）介导的先天免疫调节，且选择性地调控一组TLR2信号活化缓慢持续诱导的晚期反应炎症因子的表达。目前尚未见有关lncRNA NEAT1在结核病中的研究报道。

本研究采用RT-PCR技术检测了肺结核患者和健康对照者PBMC中lncRNA NEAT1的表达，结果表明，lncRNA NEAT1在肺结核组中表达明显升高(P＜0.01)。初、复治肺结核患者之间lncRNA NEAT1表达未见明显差别。本研究中，根据肺结核患者肺部空洞的有无及空洞所占肺野数分为无空洞组、空洞1~2肺野组、空洞3~4肺野组以及空洞5~6肺野组。结果显示，lncRNA NEAT1在各组间差异有统计学意义，即NEAT1随着空洞累及范围的增加而升高。

本研究对部分初治肺结核患者随访6个月，期间患者严格按照标准抗结核治疗方案接受治疗，均未接受放化疗等其他治疗，且患者抗结核治疗效果良好。结果发现与未接受治疗组患者相比，lncRNA NEAT1在抗结核治疗3个月时表达明显下降（P＜0.05），且随着治疗时间延长，lncRNA NEAT1表达量逐渐降低。当接受6个月抗结核治疗后，随访患者lncRNA NEAT1表达量已下降至正常水平，与健康对照组比较无统计学差异。

综上所述，本研究发现肺结核患者PBMC中lncRNA NEAT1表达显著升高，与结核病严重程度相关，且其表达变化反映抗结核治疗的疗效，有望作为评估患者预后的检测指标。进一步探究lncRNA NEAT1在结核病中的生物学功能及其分子机制，将为结核病的诊断或治疗提供新的靶点。

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Expression and clinical significance of lncRNA NEAT1 in peripheral blood mononuclear cells from patients with tuberculosis

YAO Fangyi，HUANG Zikun，XIONG Guoliang，et al.Department of Immunology，Faculty of Basic Medical Science，Nan-chang Uniuersity，Nanchang 330006，China.

Objective To explore expression and significance of long non－coding RNA(lncRNA)nuclear enriched abundant transcript 1(NEAT1)in pulmonary tuberculosis(TB)patients.Methods The expressions of lncRNA NEAT1 in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in 65 hospitalized pulmonary TB patients，30 healthy controls were analyzed by real－time quantitative PCR(RT－PCR).Results The relative expression levels of lncRNA NEAT1 in TB patients were 4.90±0.72 times of that in healthy controls(P＜0.01).There were no significant differences between new cases and relapsed cases on the expression of lncRNA NEAT1 (P＞0.05).However，the expression of lncRNA NEAT1 were correspondingly higher when cavitation existed and when cavitation was increased in size(P＜0.05).The levels of lncRNA NEAT1 were gradually decreased down to normal upon the treatment pharmacotherapy.Conclusion The levels of lncRNA NEAT1 are increased in TB patients，and the levels of lncRNA NEAT1 had relations with the development and outcome of TB.The alterations of lncRNA NEAT1 in PBMC during the period of pharmacotherapy might be a potential indicator for the prognosis of TB.

Tuberculosis；LncRNA NEAT1；Prognosis

R521，R446.62

A

1674－1129(2017)01－0005－04

10.3969/j.issn.1674－1129.2017.01.002

2016-07-27；

2016-12-29)

国家自然科学基金项目（81560001）；江西省青年科学基金项目（20142BAB215057）；江西省科技支撑计划项目（20151BBG70208）；江西省教育厅青年基金项目（GJJ14176）；江西省卫生和计生委科技项目（20161018）

姚芳苡，女，1988年生，学士学位，技师，医学检验，南昌大学基础医学院免疫学在职硕士研究生，主要研究方向：抗感染免疫。

黄自坤，男，1986年生，主管技师，E-mail:yfyhzk@163. com，主要研究方向：抗感染免疫；傅颖媛，女，1954年生，教授，E-mail:hqfyy@126.com主要研究方向：抗感染免疫。