通过CRISPR/Cas系统构建miR-17-92基因簇双切载体1)

金姝含 杜丽萍 邹肖肖 于泽 梁洋

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



通过CRISPR/Cas系统构建miR-17-92基因簇双切载体1)

金姝含 杜丽萍 邹肖肖 于泽 梁洋

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

通过CRISPR/Cas系统来构建miR-17-92基因簇的双切载体，研究结果表明：在miR-17-92基因簇的序列上找到了2个PAM(TGG和GGG)位点,从而得到了2个原间隔序列，设计合成基因簇双链crRNA；合成该片段并将其插入到pX260载体，使得在同一个载体上虽然只有一个g-RNA，但能够同时切割两个不同的靶位点；将该载体转染NIH3T3细胞验证切割效率，PCR结果和测序结果显示，所构建的CRISPR系统可以对基因片段进行有效切割。

CRISPR/Cas系统；miR-17-92基因簇；双切载体；crRNA

We constructed double-cut carrier ofmiR-17-92 gene cluster using CRISPR/Cas9 system. We identified two PAM and two protospacesare, and designed pre-crRNAs. The synthesized pre-crRNAs (that was the designed annealing oligonucleotides based on the sequence specific) were inserted between the pX260 carrier. Therefore，there is only one g-RNA in the same carrier, cutting two different target sites at the same time. NIH3T3 cells were transfected by plasmid of pX260 carrier including pre-crRNAs for the cutting effect. ThemiR-17-92 gene was cut by CRISPR/Cas system.

2013年初，一种全新的CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9))基因组定点改造技术出现，即利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割，该技术一经问世，便迅速被应用到各种基因组编辑中，并明显提高了编辑效率和准确度。最近研究表明，利用CRISPR/Cas9技术，也能单酶切miRNA，使得小鼠细胞中miRNA的水平被敲低[1]。

MicroRNA(miRNAs)是内源性非编码小RNA，大小约为20～22个核苷酸,存在于真核基因组中，不编码蛋白，而是通过抑制靶基因mRNA的翻译或将其降解，在转录或翻译水平调节相关基因表达[2]。有研究预测其能够负向调控哺乳动物中一半以上的蛋白质编码基因[3]，在生物体的早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等方面发挥重要的生理作用[4]。近年研究还发现，miRNA能够影响肿瘤的发生、发展[5]。

在脊椎动物中，miR-17-92基因簇序列十分保守,编码miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1等7个miRNAs[6]，这些miRNAs在基因组上成簇存在,并以多顺反子形式转录。目前miR-17-92基因簇与哺乳动物器官发育，以及多种肿瘤发生密切相关。在淋巴瘤、肺癌、白血病、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌等很多肿瘤细胞中均存在高表达[7]。但同时，也有研究发现，在人类GBM异种移植的小鼠中，miR-17-92的表达提高了CAR-T-细胞抗肿瘤的活性[8]。因此目前认为，miR-17-92基因簇可能具有癌基因和抑癌基因双重功能，但对其具体作用机制的研究尚不清楚。

综上所述，为了探讨miR-17-92基因簇在疾病尤其是癌症发生中的作用机制，本文通过CRISPR/Cas系统构建miR-17-92基因簇的双切载体，使得在同一个载体上能够同时切割两个不同的靶位点，得到了miR-17-92基因簇缺失突变，并降低了脱靶率和移码突变的可能性，为进一步利用miR-17-92基因簇进行疾病和肿瘤发生机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

pX260载体和NIH3T3细胞，由本实验室保存。

限制性内切酶Bbs1，T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒购自Omega公司；琼脂糖购自Biowest公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；其余试剂为国产分析纯试剂；PCR引物合成以及测序分析由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.1 crRNA序列的设计

利用NCBI上的BLAST得到小鼠miR-17-92基因簇序列，通过生物信息学方法，在该序列上找到2个PAM(TGG和GGG)位点，从而得到了2个原间隔序列，分别为：

5’-ATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGGG-3’，

5’-CCAGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAG-3’。

通过primer5设计含有BbS1酶切位点的引物，由生物公司合成crRNA，序列为：5’…CAAACATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGTT…AACGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAGGTTTTAG…-3’。

1.2 质粒载体的构建

用Bbs1酶对pX260载体进行酶切(图1)，酶切体系50 μL，37 ℃，60 min。回收线性载体，用小牛碱性磷酸酶CIP去除线性质粒载体5’端磷酸，将退火后的crRNA插入到2个Bbs I酶切位点之间，用T4 DNA连接酶，连接产物转化并提取质粒，最终得到了小鼠miR-17-92基因簇的双切载体，并进行进一步的检测。

图1 pX260载体图谱

1.3miR-17-92基因簇双切载体切割效率检测

NIH3T3细胞系的培养：NIH3T3细胞复苏后传代培养(DMEM合成培养基：含10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%双抗)，待细胞传2代以后准备转染。

转染：转染前1天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为50%～60%，细胞铺24孔板，添加0.5 mL DMEM合成培养基(不含抗生素)；对于每孔细胞，加入miR-17-92基因簇的双切载体质粒0.3 μg，脂质体2 000 1 μL，37 ℃，5%的CO2中培养24 h。

基因组检测：利用试剂盒提取NIH3T3细胞全基因组，以该基因组为模板，在小鼠miR-17-92基因簇序列上利用prime5设计检测引物P1和P2，进行PCR检测和测序分析，扩增长度约为1 548 bp。

检测引物序列为：

P1：5-ACGGATGTGAATCTTGGTGGGTT-3，

P2：5-GAAACCAACTGTGCTGCCCAAATG-3。

PCR条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；53 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min 30个循环，反应体系为20 μL。

并参考左其生[9]，俞珺瑶等的方法[10]，利用Image J软件分析条带的灰度值，公式为：

相对切割效率=突变产物剪切条带灰度值/(突变产物剪切条带灰度值+未突变条带灰度值)。

2 结果与分析

2.1 crRNA序列的设计

通过NCBI数据库得到小鼠miR-17-92基因簇序列，利用生物信息学方法，在该序列上找到两个PAM(TGG和GGG)位点(下划线标注)，从而得到了两段原间隔序列(protospace(1)和(2)，图2中两段着重显示部分)，三角形标记表示核酸酶spCas9的切点位置，进而设计了小鼠miR-17-92基因簇crRNA序列(5’…CAAACATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGTT…AACGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAGGTTTTAG…-3)，由生物公司合成该段序列。

2.2 CRISPR/Cas系统miR-17-92基因簇双切载体的构建

图2显示了通过CRISPR/Cas系统构建的miR-17-92基因簇双切载体结果。通过Bbs1酶对pX260载体进行双酶切，将合成的双链crRNA片段插入到两个Bbs I酶切位点之间(箭头标注)，作为引导序列，最终得到了小鼠miR-17-92基因簇的双切载体，用于以下的检测实验。

2.3miR-17-92基因簇双切载体的检测

为了检测所构建载体的切割效率，将该载体转染NIH3T3细胞，并提取细胞全基因组，再通过PCR法、灰度分析法和测序方法分别检测基因组中miR-17-92基因簇的切割情况。

2.3.1 PCR检测

利用引物P1P2进行PCR检测，图3结果显示：1泳道为对照组，即空载体转染NIH3T3细胞，扩增的miR-17-92基因片段，约1 548 bp左右，没有切割现象；2泳道为试验组，即miR-17-92基因簇双切载体质粒转染NIH3T3细胞组，由于很难达到100%切割，因此显示两条带，上端为未被切割的片段，约1 548 bp左右，下端为被切割后修复的片段(条带标记为3)，由于中间切割碱基长度约为948 bp左右，因此切割后重组长度约600 bp左右。4号标记为无条带空白位置，用于灰度分析。

图2 CRISPR/Cas系统miR-17-92基因簇双切载体的构建

1.对照组；2.试验组；3.切割后修复条带；4.空白；M.star markerⅡ。

2.3.2 灰度分析切割效率

表1显示上述PCR条带灰度分析结果。通过Image J软件进行灰度分析，根据公式，突变产物剪切条带灰度值/(突变产物剪切条带灰度值+未突变条带灰度值)，可以初步判断切割效率[9-10]。结果显示：所构建的CRISPR/Cas9系统对miR-17-92基因簇切割效率为7.04%左右(切割效率分析(3-4)/(2+3-4)=(57.358-48.966)/(110.787+57.358-48.966)=7.04%)。

表1 PCR条带灰度分析切割效率

注：1为对照；2为未被切割的片段；3为切割后修复片段；4为空白对照。

2.3.3 测序分析

将上述PCR结果送到生物公司进行测序，分别利用DNAMAN软件和NCBI blast进行分析，结果显示：利用构建的CRISPR/Cas系统miR-17-92基因簇双切载体质粒转染小鼠NIH3T3细胞后，miR-17-92基因的确被有效切割，切割长度约为948 bp左右，与理论值相符(图4和图5)。

图4 DNAMAN分析结果

3 结论与讨论

microRNAs(miRNAs)是高度保守的一种非编码小RNA，通过抑制靶基因mRNA的翻译或将其降解,在转录后水平调控基因的表达。Bartel D P等[4]发现这些miRNAs在基因组上成簇存在,以多顺反子形式转录。参与调控哺乳动物器官发育以及疾病的发生，因此受到了广泛关注。其中miR-17-92基因簇的序列十分保守，位于人类基因组第13号染色体上C13orf25基因初级转录本的第3个内含子区，在小鼠基因组中位于第14号染色体上[11],编码miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1等7个miRNAs。研究显示，miR-17-92基因簇与多种肿瘤的发生密切相关，可能具有癌基因和抑癌基因双重功能，因此通过基因编辑等技术对miR-17-92基因簇作用机制进行深入研究十分必要。

图5 NCBI blast分析结果

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)基因组编辑技术，是一种新型打靶技术，基本可以在任意基因位点进行有效断裂，且具有可以同时对多个基因进行打靶的优势。2013年初，有研究首次报道了利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现了定点突变[8]。同一期的Science杂志也发表了另一篇文章，通过利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成单链或双链的切口，从而能够激活细胞的DNA修复机制，高效地介导外源基因的定点插入[12]。2014年有研究结果显示，在小鼠中，使用特异性的gRNAs，可以单酶切miRNA，使得在小鼠细胞中miRNA的水平被敲低[13]。

以往研究结果显示，所构建的CRISPR/Cas9载体系统只有一个crRNA，Cas9蛋白只对一个位点进行切割，容易造成移码突变，且不能将感兴趣的整个基因座全部切下。如果设计两个CRISPR/Cas9系统时，又会明显降低敲除效率[12]，影响试验结果。因此，为了解决上述问题，本试验设计了CRISPR/Cas9双切miR-17-92基因簇载体系统，即在一个载体上虽然只有一个crRNA，但是能识别两个切割位点，实现同时切割两个不同靶位点的功能。

本试验首先通过分析miR-17-92基因簇的序列，找到两个PAM(TGG和GGG)位点，从而得到了两个原间隔序列，将其合并设计合成一段pre-crRNA序列，该序列能识别两个Cas9切割位点，避免了同时设计两段crRNA所造成的切割效率降低问题。随后利用限制性内切酶BbsI，对pX260载体进行酶切，将上述合成的pre-crRNA片段插入到BbsI酶切位点之间，克隆后得到CRISPR/Cas9系统miR-17-92基因簇双切载体质粒。本试验利用的pX260载体与以往实验有所不同，拥有3个表达盒，即crRNA与tracrRNA两个表达盒能分开表达，而常规pX330载体具有两者合并为一个gRNA的表达盒[1]。基因敲除时crRNA与tracrRNA两个表达盒分开表达效率高于单一的gRNA表达盒，因此，实验设计crRNA与tracrRNA分开的两个表达盒，以提高miR-17-92基因簇的切割效率[8]。

最后将该载体质粒转染NIH3T3细胞，分别通过PCR法和测序分析方法鉴定载体构建情况(图4,5,6)，测序结果显示：所构建的CRISPR/Cas9双切miR-17-92基因簇载体能够切割基因组长度约900bp左右，与设计结果相符，没有发生移码突变。参考其他文献结果通过Image J软件对PCR条带进行灰度分析，初步检测切割效率约为7.04%，虽然切割效率不是很高，但实现了通过载体上的一个crRNA，Cas9可以识别两个切割位点，从而将感兴趣的基因座上序列全部切割的结果，简化了设计和操作步骤，并降低了点突变所产生的脱靶率和移码突变的可能性。

综上所述，本文利用CRISPR/Cas9系统介导的基因打靶技术，具有同时对多个基因进行打靶的优势，能快速简单的敲除基因簇。而且我们设计的CRISPR/Cas9系统是一个双切载体，在同一个载体上利用一个cr-RNA，实现同时切割两个不同靶位点的效果，提高了突变效率，减少了移码突变。由于miR-17-92基因簇与哺乳动物多个器官发育和肿瘤发生有着密切的关系，如果将该双切载体应用在小鼠，哺乳动物甚至人类上，那么就可以快速了解miR-17-92基因簇功能，为进一步阐明其在器官发育和肿瘤发生发展中的分子机制，以及相关疾病预防，诊断和治疗奠定基础。

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Double-cut Carrier in ConstructingmiR-17-92 Gene Cluster by CRISPR/Cas9 System//

Jin Shuhan, Du Liping, Zhou Xiaoxiao, Yu Ze, LiangYang(Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)//

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CRISPR/Cas9 system;miR-17-92 gene cluster; Double-cut carrier; crRNA

1)中央高校基本科研业务费项目(2572016EAJ3)；淡水鱼育种国家地方联合工程实验室开放课题(KF-2015-003)；东北林业大学生命科学学院大学生创新训练项目。

金姝含，女，1994年2月，东北林业大学生命科学学院，本科生。E-mail：jinshuhan123@163.com。

梁洋，东北林业大学生命科学学院，高级工程师。E-mail：liang11yang@126.com。

2016年7月13日。

Q291

责任编辑：潘 华。