饲料中霉菌毒素检测新方法研究

（1.唐山市畜牧水产品质量监测中心河北唐山063000；2.中检环贸生物技术（北京）有限公司北京100012）

饲料中霉菌毒素检测新方法研究

蒙君丽1，张志云2

（1.唐山市畜牧水产品质量监测中心河北唐山063000；2.中检环贸生物技术（北京）有限公司北京100012）

近年来随着国家粮库粮食的过饱和，老旧粮库储存条件差，雨水过多等因素，导致饲料原料霉菌毒素污染严重，因其对动物的危害明显，使得检测量与日俱增。而霉菌毒素的高毒性特点又使得检测人员唯恐避之不及，常年接触高毒性、易挥发的标准品是危害检测人员安全的重要因素，寻找一种安全、快速、准确的霉菌毒素检测方法迫在眉睫。论文就霉菌毒素的检测方法进行了归纳分析，为今后健全霉菌毒素检测方法，减轻霉菌毒素对畜牧业的危害提供参考依据。

霉菌毒素；危害；检测方法

1 霉菌毒素的危害

霉菌毒素是霉菌产生的高毒性次级代谢产物，目前已发现的霉菌毒素多达300～400种。以黄曲霉毒素B1为例，其毒性是砒霜的68倍；玉米赤霉烯酮有很强的雌性激素作用；脱氧雪腐镰刀菌烯醇可以引起动物的呕吐；而近年来的研究表明，在多种霉菌毒素的作用下，对动物的伤害是成指数上升的，严重威胁着人畜健康。

2 霉菌毒素的检测方法

为了控制霉菌毒素对人畜的威胁，各国均出台了各种对霉菌毒素的检测方法标准及检测限量。

2.1 薄层色谱法

薄层色谱法（Thin layer chromatography,TLC）[1]，该方法的优点是经济、对设备和检测人员要求不高。缺点是精确度低、操作过程复杂、分析结果的可重复性和再现性差，因此TLC方法近年来使用频率越来越少。

2.2 酶联免疫吸附法

最具有代表的免疫分析检测方法就是酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）。该方法具有检测样本量大，时间短，效率高等优点，但该方法存在重现性较等很多干扰因素[2-3]，因此该方法多用于样本的快速检测或筛查。

2.3 高效液相色谱和液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）[4]是目前定量检测的主要方法。其优点是集液相色谱的高分离度和质谱检测的通用性、可以提供分子结构信息、灵敏度高、选择性好，为同时检测多种霉菌毒素提供了新的方向。

2.4 胶体金法

免疫胶体金技术（Immune Colloidal Gold Technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于样品中待分析物检测的一种免疫检测技术，可用于样品中待检测物质的快速定性或定量检测，是一种稳定、灵敏的检测方法。

3 胶体金定量检测法的优势

目前，我国国标的检测方法都是采用免疫亲和柱和净化柱和高压液相色谱的方法对霉菌毒素进行检测，具有高灵敏度，结果准确等优点。但是国标方法作为霉菌毒素检测的标准方法，需要大型设备，需要购买相应的免疫亲和柱，前处理过程复杂，需要配需专业人员，检测成本高，过程复杂，且检测过程中需要接触高毒性的标准品，不适合常年做大量实验的监督检测。

近年来，国际上推出了霉菌毒素定量检测条，配合专用的读数仪，可以在十几分钟内完成霉菌毒素的快速定量检测，其检测结果与国标仪器方法具有较高的吻合度。不仅能够准确地提供所检测样品被霉菌毒素污染的程度，也为样品今后的处置提供了数据基础，在国际上得到了广泛的应用[5]。

3.1 高效液相色谱法与胶体金定量检测法的前处理对比

以呕吐毒素为例，高效液相色谱法前处理过程[6]：

1）提取：称取粉碎试样约50 g（精确到0.1 g）置于250 mL具塞锥形瓶中，加入10 g聚乙二醇及200 mL水，高速均质2 min，或振荡器振荡60 min。静置，通过快速定性滤纸过滤，利用玻璃纤维滤纸进行1～2次过滤，使滤液澄清，随即通过免疫亲和柱进行净化。

2）净化：把免疫亲和柱与10 mL玻璃定量管进行连接。向玻璃定量管中加入1 mL澄清提取液，连接玻璃定量管与空气压力泵，调节压力，使溶液以1.8 mL/min的流速通过免疫亲和柱，至一部分空气通过柱体。以5 mL水对免疫亲和柱进行1次清洗，弃全部流出液；使5 mL空气通过免疫亲和柱。向柱中加入1 mL甲醇进行洗脱，流速为0.8 mL/min，在玻璃试管中收集洗脱液，在45℃条件下用氮吹仪50℃进行吹干。用0.5 mL流动相对残渣进行溶解，涡旋混匀，过0.45um滤膜，供液相色谱测定。

胶体金快速定量法前处理过程[7]：准确称量10.00 g试样于200 mL具塞锥形瓶中，加入50.0 mL水，密闭，用涡旋振荡器振荡1～2 min，静置后用滤纸过滤，货取1.0～1.5 mL混合液于离心管中，用离心机（4 000r/min）离心1 min。取滤液或离心后上清液100 uL于另一离心管中，加入1.0 mL稀释缓冲液（试剂盒自带），充分混匀待测。

3.2 高效液相色谱法与胶体金定量检测法的检测步骤对比

高效液相色谱法检测步骤

1）选定液相色谱测定条件（全英文操作界面）：①色谱柱：C18柱，柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 um或相当者；②流动相：量取100 mL乙腈至1 000 mL的容量瓶中，加入水定容至1 000 mL。混合均匀并通过0.45 um滤膜；③流速：0.8 mL/min；④检测波长：218 nm；⑤进样量：20 uL；⑥柱温：室温。

2）色谱测定：分别取试样溶液和标准工作液各20 ul（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行测定，以标准工作液浓度为纵坐标，以峰面积积分值为横坐标，绘制标准工作曲线，以保留时间定性，用标准工作曲线对试样进行定量。

胶体金定量检测条检测步骤：

1）将胶体金检测条从冷藏状态（2℃～8℃）取出放置至室温。将孵育器预热至45℃。将检测条平放在孵育器凹槽中，打开加样孔。

2）准确移取300 uL待测溶液，加入检测条加样孔中，关闭加样孔及孵育器盖。

3）孵育5min后，取出检测条观察C线（质控线）T线（检测线）显色情况。若出现：①C线不出现；②C线出现，但弥散或严重不均匀；③C线出现，但T1或T2线弥散或严重不均匀等情况视为无效检测。

4）选择读数仪的呕吐毒素检测频道，开始样品测定，测定大概需要5 s完成，显示定量结果。

4 胶体金定量检测法的验证实验

4.1 参试产品信息

4.1.1 仪器类型 ①ROSA孵育器（编号：LF-INC4-5-45D）、ROSA-M 读 数 仪 （编 号 ：LF-ROSAREADER-M-NB）；②定量检测条类型：黄曲霉毒素快速定量检测条（0-150ppb）、呕吐毒素快速定量检测条（0-6ppm）、玉米赤霉烯酮快速定量检测条（0-1400ppb）；③生产企业：美国Charm公司；④生产地：美国马萨诸塞州。

4.1.2 目标分析物和基质提议①检测项目：黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮；②基质：玉米、玉米粒、豆粕、豆粕粒、麸皮、粗麸、粉碎玉米、参考物质。

4.1.3 评价实验用到的仪器设备高效液相色谱（型号：安捷伦1200）。

4.1.4 检测所用定量试剂条批号①黄曲霉毒素快速定 量 检 测 条 ：B002003S-03、B002003S-07、B002003S-09；②呕吐毒素定量检测条：B006010A-04、B006010A-06、B006010A-08；③玉米赤霉烯酮定量检测条：B001002T-22、B001002T-25、B001002T-27。

4.2 样品说明

选取经过确认无污染的玉米（5份）、玉米粒（3份）、豆粕（5份）、粗麸（4份）、粉碎玉米（3份）共计20份作为阴性样品；采集玉米、玉米粒、豆粕、豆粕粒、麸皮、粗麸、粉碎玉米为自然样品，自然样品还选取了Charm公司的玉米质参考物质。

4.3 实验过程

检测过程：定量检测条按照检测条说明书进行，参考方法选用GB18979-2003、GB-T5009-209-2008、GB-T23503-2009。

4.4 实验结果

4.4.1 黄曲霉毒素B1

1）检测限和定量限：取20个无污染样品的检测结果，进行计算，检测限（LOD）是结果平均值加3倍标准偏差，定量值（LOQ）是结果平均值加10倍标准偏差。测试结果表明，黄曲霉毒素B1的LOD是2ppb，LOQ是5 ppb。

2）线性范围：将ROSA快速定量检测条的结果作为纵坐标，将高效液相色谱标准法的检测结果作为横坐标，对线性范围进行计算：5～150ppb（5点）；回归方程：y=x-639；相关系数r为0.9993（如图1）

图1 黄曲霉毒素B1线性范围

3）与参考方法参考值比较：通过高效液相色谱法与ROSA检测条方法，分别检测9组阳性样品，通过配对t检验法，对两种方法的检测结果是否存在显著性差异进行比较。经计算，tD=0.41，查t分布表，t0.05,8=2.31，tD=0.41＜t0.05,8=2.31,说明液相色谱参考值与ROSA测定值之间无显著差异。

4）以高效液相色谱法的测定结果为认定值，将ROSA快读定量检测条的测定结果与之进行比较，按正确度（%）=检测值/认定值x100计算。正确度范围在75.3%～120%之间，平均为99%。

5）选择6个参与测试人员，按照同一种方法，在同一间实验室中，采用不同设备，对相同样品进行检测，重复测定的变异系数在15.5%～20.4%，平均变异系数为16.9%。

4.4.2 呕吐毒素

1）检测限和定量限：取20个无污染样品的检测结果进行计算，以测定平均值加3倍标准偏差作为检测限（LOD），以测定平均值加10倍标准偏差作为定量值（LOQ）。测试结果表明，呕吐毒素的LOD是118ppb，LOQ是316ppb。

2）线性范围：将ROSA快速定量试剂条的检测结果作为纵坐标，将高效液相色谱法检测结果作为横坐标，计算线性范围：500～5 000ppb（5点）；回归方程：y=1.16x-5.49;相关系数r为0.9987（如图2）

图2 呕吐毒素线性范围

3）与参考方法参考值比较：选择ROSA检测条与高效液相色谱标准方法，分别检测11组阳性样品，采用配对t检验法，对两种方法的检测结果是否存在显著性差异进行。经计算，tD=1.6，查t分布表，t0.05,10=2.23，tD=1.6＜t0.05,10=2.23,说明液相色谱参考值与ROSA测定值之间并无显著差异。

4）将高效液相色谱法的测定结果作为认定值，将ROSA快读定量检测条的检测结果与认定值进行比较，按正确度（%）=检测值/认定值x100计算。正确度范围在90.3%～133.9%之间，平均为106%。

5）选择6个参与测试人员，按照同一种方法，在同一间实验室中，采用不同设备，对相同样品进行检测，重复测定的变异系数在4.7%～19.6%，平均变异系数为11.8%。

4.4.3 玉米赤霉烯酮

1）检测限和定量限：取20个无污染样品的检测结果进行计算，以测定平均值加3倍标准偏差作为检测限（LOD），以测定平均值加10倍标准偏差作为定量值（LOQ）。测试结果表明，呕吐毒素的LOD是5ppb，LOQ是14ppb。

2）线性范围：将ROSA快速定量试剂条的检测结果作为纵坐标，将高效液相色谱法检测结果作为横坐标，计算线性范围：30～1 000ppb（7点）；回归方程：y=0.84x+35.1；相关系数r为0.998（如图3）

图3 玉米赤霉烯酮线性范围

3）与参考方法参考值比较：选择ROSA检测条，与高效液相色谱法，分别对14组阳性样品进行检测，采用配对t检验法，对两种方法的检测结果是否存在显著性差异进行比较。经计算，tD=0.3，查t分布表，t0.05,13=2.16，tD=0.3＜t0.05,13=2.16,说明液相色谱参考值与ROSA测定值之间无显著差异。

4）把高效液相色谱法的测定结果作为认定值，将ROSA快读定量检测条的测定结果与认定值进行比较，按正确度（%）=检测值/认定值x100计算。正确度范围在86.3%～133.9%之间，平均为117%。

5）6个参与测试人员在相同实验室，按照统一方法，采用不同设备，检测相同样品，进行重复测定的变异系数在8.4%～22.6%，平均变异系数为17.3%。

5 实验结论

该胶体金检测系统能够定量检测饲料主要组成成分玉米、豆粕、麸皮、粗麸等饲料中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，可以满足饲料中霉菌毒素的快速定量检测需要。该系统照传统方法最大的优点在于：安全（无需接触标准品）、简单（前处理及检测步骤简单易学，无需专业人员）、快速（十几分钟即可得到定量结果）、准确（与高效液相色谱法结果高度吻合）、成本低等等。可以作为饲料中检测霉菌毒素的主要方法。■

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[6] GBT30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法[S].

[7] LS/T 6113-2015粮油检验粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法[S]

A New Method for the Detection Mycotoxins in Feed

Meng Junli1,Zhang Zhiyun2
（1.Tangshan city animal husbandry and aquatic products quality monitoring center，TangShan HeBei，063000；2.The ring in the check trade biological technology(Beijing)co.,LTD，BeiJing，100012）

in recent years as the country of grain supersaturated,poor old grain storage conditions,factors such as,too much rain in feed ingredients mycotoxin pollution is serious,because of its harm to animals,increasing the flow detection.And high toxicity and makes detection of mycotoxin lest shun,perennial exposed,highly toxic volatile criterion is an important factor,which endanger the safety of the inspectors to find a safe,rapid and accurate mycotoxin detection method is imminent.Paper has carried on the induction analysis of mycotoxin detection methods,improve the mycotoxin detection method for the future,reduce the mycotoxin provides reference to the harm of animal husbandry.

Mycotoxins;Harm;Detection method

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.041