万古霉素软膏剂的制备及效果评价

郭善军　张晓林　曾吉祥

摘 要 制备出具有良好抑菌效果的万古霉素软膏，并初步评价其透皮释放性能。采用乳化法制备O/W型和W/O型两种万古霉素软膏。通过比较这两种软膏的物理性状、体外透皮释放率、体外抑菌、动物药效学等质量评价实验结果，确定更优的软膏剂制备处方并初步建立万古霉素软膏剂透皮实验方法。实验结果表明，O/W型万古霉素软膏的制备工艺简单，制剂稳定性好，抑菌效果快速强效。

关键词 万古霉素 软膏剂 透皮制剂 生物被膜

中图分类号：R681.2 文献标识码：A

万古霉素是一种糖肽类抗生素，临床上主要用于治疗由其他抗生素不敏感的革兰氏阳性菌所引起的严重感染，如肺炎等。随着抗生素的乱用，导致细菌感染的疾病增多，终止最为抗生素最后一道防线的万古霉素的临床使用增加，为了更好地指导临床用药，有必要对万古霉素软膏剂进行研究。

1材料

2000高效液相色谱仪（日本日立公司），RYJ-6B 药物透皮扩散试验仪（上海沪粤明科学仪器有限公司），AB135-S 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），XK97-A 菌落计数器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），DHP-9162电热恒温培养箱（上海市齐欣科学仪器有限公司），SW-CJ-TD 无菌操作台（苏州净化有限公司），S-3000N 掃描电镜（HITACHI）。万古霉素（大连美伦生物技术有限公司），十八醇、丙二醇、白凡士林、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十二烷基磺酸钠、液状石蜡均为药用级。

2方法

2.1处方的组成

根据查阅的相关文献和单因素实验筛选出了W/O型和O/W型2个最优处方。W/O型处方：单硬脂酸甘油酯15g，硬脂酸5.0g，白凡士林15g，液状石蜡14g，氢氧化钙的饱和水溶液50g，万古霉素1.0 g。O/W型处方：十二烷基硫酸钠1.5g，白凡士林17g，丙二醇10g，水50g，十八醇20g，氯化钙0.5g，万古霉素1.0g。

2.2软膏剂制备

2.2.1 O/W型软膏剂的制备

称取处方标识量中的十八醇、丙二醇、白凡士林，在70℃的水浴下加热融化为油相，称取处方标识量的氯化钙、万古霉素、水，在70℃的水浴下加热融化为水相。然后再剧烈搅拌，将水相缓缓倾入油相中，使其成软膏状，即得到O/W型万古霉素软膏剂。

2.2.2 O/W型软膏基质的制备

按2.2.1中方法进行制作，只是不加主要万古霉素。

2.2.3 W/O型软膏剂的制备

称取处方中标识量的单硬脂酸甘油酯、液状石蜡、硬脂酸、白凡士林，在70℃的水浴中加热融化为油相，称取处方标识量的万古霉素、氢氧化钙的饱和水溶液，在70℃的水浴中加热融化为水相。在剧烈搅拌下，将水相缓缓倾入油相中，使其成软膏状，即得到W/O型万古霉素软膏剂。

2.2.4 W/O型软膏基质的制备

按2.2.3中方法进行制作，只是不加主要万古霉素。

2.3质量评价

2.3.1性状观察

对两种软膏剂的颜色及外观形态进行观察。

2.3.2稳定性考察

（1）耐热耐寒实验。分别取适量的W/O型和O/W型软膏剂，在55℃的恒温水浴中保存24h，取出后放至室温，再在-20℃下放置24h，最后取出样品，观察样品有无液化、变色、分层、粗化等现象。

（2）高速离心实验。分别称取适量的W/O型和O/W型软膏，在4000 r·min-1转速下离心30 min，观察有无分层、液化等现象。

2.4体外透皮释放量测定

2.4.1建立标准曲线

精密称取万古霉素2.02mg于容量瓶中，用蒸馏水定容至10mL，摇匀，作为储备液。紫外分光光度计全波长扫描确定万古霉素的最大吸收波长为236nm，以236nm作为检测波长。

（1）液相色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（150mm€？.6mm，5 m）；流动相是乙腈-0.05mol/L磷酸铵缓冲盐（8∶92）；检测波长236nm；流速1mL·min-1；最低检测限0.8ng 。

（2）线性回归方程的确定

精密配制浓度分别为3.1625 g·mL-1、6.325 g·mL-1、12.65 g·mL-1、25.3 g·mL-1、50.6 g·mL-1、101.2 g·mL-1、202.4 g·mL-1的万古霉素溶液，以236nm作为检测波长，每次进样量10 L，将浓度与峰面积进行回归即可得标准曲线。

（3）回收率实验

称取适量万古霉素，配制浓度分别为5.0 g·mL-1、50 g·mL-1、150 g·mL-1的标准溶液。将三种不同浓度的万古霉素溶液各分为两份，分别在每份中加入W/O型和O/W型基质，在70℃水浴中使基质全部融化，混匀，离心，用0.22 nm的虑膜过滤，经HPLC分离后在236nm处检测，计算其回收率。

2.4.2离体鼠皮的准备

2.4.3透皮实验方法

配制一定量的生理盐水作为释放液。接收池中灌入6.5mL的生理盐水，让液面与接收池瓶口齐平。再在接收池瓶口盖上离体鼠皮（皮肤的角质层朝外），将释放池盖在离体皮肤上，最后用夹子将释放池、接收池、离体皮肤固定。把透皮释放装置放于37℃透皮实验扩散仪中，待接收池中温度也维持在37℃时，分别将适量的W/O和O/W两种软膏均匀的涂抹在离体皮肤上，转速设为300 r/min。分别在第0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h等不同时间点取样，取样量为100 L，取样后向接收池中加入等量 37℃生理盐水。将取得的样品经离心、0.22nm微孔滤膜过滤，最后在HPLC上检测样品中万古霉素的浓度。

2.5软膏剂体外抑菌效果试验

2.5.1药皿抑菌试验

取1mL的金黄色葡萄球菌的菌液加入到含2%琼脂粉的肉汤培养基中摇匀，再将这含有细菌的培养基倒入1个培养皿中（每个培养皿含有25mL培养基），待培养基冷却凝固后，在平板上平分区域打出4个大小一致的孔，在每个小孔中分别加入等量的O/W型软膏基质、W/O型软膏基质、O/W型万古霉素软膏、W/O型万古霉素软膏。37℃恒温培养箱中培养12h后测量其抑菌圈直径的大小。

2.5.2对金黄色葡萄球菌生长的影响

体外透皮抑菌实验与体外透皮释放实验相识，以6.5mL金黄色葡萄球菌稀释液（0.1mL的金黄色葡萄球菌菌液和6.4mL的生理盐水释放液）作为释放液。取出的0.1mL的样品通过平板稀释菌落计数法计算其中的细菌量。

2.6软膏剂动物药效试验

将36只体重约为20g健康小白鼠，雌雄各半，平分为6组，其中每组雌雄各半。用硫化钠溶液脱去小鼠背部大约4cm2面积的毛，露出裸露皮肤，用生理盐水清洗干净。用灭菌后的刀片在小鼠背部裸露皮肤处划下一个“井”字形的伤口，每天在“井”伤口中央皮下注射5 L的金黄色葡萄球菌菌液，连续注射3d。5d后每只小鼠背部伤口处都有化脓感染现象，且在“井”中央还有凸起。然后从第6d开始，按组分别在小鼠背部“井”伤口中央涂抹适量的O/W型软膏基质、W/O型软膏基质、O/W型万古霉素软膏、W/O型万古霉素软膏、市售红霉素软膏以及无菌生理盐水，并且每天观察伤口愈合情况。

3结果

3.1软膏剂的质量评价结果

所制得的W/O型和O/W型万古霉素软膏剂为白色膏状物，通过耐热耐寒、高速离心试验后，均无变色、分层、粗化、液化等现象，说明所制备的软膏剂稳定性良好。

3.2软膏剂体外透皮释放实验的结果

3.2.1标准曲线

万古霉素的水溶液在6.33～202.40 g·mL-1的浓度范围内线性良好（如图2），线性回归方程：y=10378x-47127 ，r=0.9998。加样回收率试验结果表明该方法的加样回收率符合要求，在150 g·mL-1、50 g·mL-1、5 g·mL-1浓度下W/O和O/W型万古霉素软膏评价加样回收率分别为99.12%、99.88%，RSD分别为0.57%、076%。

3.2.2透皮试验结果

W/O型万古霉素软膏累积释放率为44.15%，O/W型万古霉素软膏剂累积释放率为53.35%，在6h后2种软膏剂药物释放均趋缓（见表2和图3）。

3.3软膏剂透皮抑菌试验结果

3.3.1软膏剂体外药皿抑菌试验结果

结果见表3。实验结果表明：W/O型和O/W型万古霉素软膏剂均能不同程度的抑制金黄色葡萄球菌的生长，而不含万古霉素的软膏剂基质则无抑菌作用。

体外透皮抑菌实验结果见图4，结果显示在给药后2h内，金黄色葡萄球菌已被杀灭大半数，8h的时候O/W型软膏组的细菌已全部杀灭，而W/O型软膏组的细菌则只有极少量的存活，表明透皮抑菌效果明显。

3.3.2动物药效的实验结果

根据给药后小鼠背部“井”字中央凸起脓包的大小和化脓伤口结疤情况来判断各实验小组治疗皮肤感染的效果，实验结果表明生理盐水组（阴性对照组）与红霉素软膏组（阳性对照组）和万古霉素的软膏组的P值都小于0.05，具有显著差异。而软膏剂的基质组与生理盐水组比较P值均大于0.05，无显著差异。在给药后的第3天，万古霉素软膏剂组的感染治愈率达100%，比阳性对照组的红霉素软膏组的治愈率明显高（见图5）。

4讨论

通過对两种不同类型的万古霉素软膏进行比较，发现O/W型万古霉素软膏的释放速度更快、抑菌效果也更好，其可能原因在于O/W型软膏中万古霉素处于乳剂外部，且万古霉素在水中的溶解度极好，因此此种软膏剂更容易分散在水中，从而发挥药效。

感染导致的，所以此实验选择了革兰氏阳性菌的典型代表金黄色葡萄球菌为实验对象万古霉素的抑菌范围主要是针对大多数的革兰氏阳性菌，在皮肤感染中多由革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌。

基金项目：四川省教育厅项目（14ZB0383）。