IL-6-174G/C及-572C/G位点基因多态性与新疆NVAF人群及民族差异性分析*

李 娜，王淑霞，木胡牙提

(新疆医科大学第一附属医院健康管理中心健康体检部，乌鲁木齐 830054)

IL-6-174G/C及-572C/G位点基因多态性与新疆NVAF人群及民族差异性分析*

李 娜，王淑霞，木胡牙提△

(新疆医科大学第一附属医院健康管理中心健康体检部，乌鲁木齐 830054)

目的 探讨新疆地区白细胞介素-6(IL-6)-174C/G及-572C/G位点的基因多态性，与非瓣膜性心房颤动(NVAF)的关系及新疆地区汉族、哈萨克族(哈族)IL-6基因多态性的民族差异性。方法 分别选择新疆地区汉族、哈族NVAF对象79、78例(汉族、哈族NVAF组)，汉族、哈族非心房颤动对象75、79例(汉族、哈族对照组)，采集静脉血提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对各组对象的IL-6基因-174G/C及-572C/G的多态性进行分析。结果 IL-6 -572G在NVAF组中等位基因频率明显高于对照组(χ2=4.076,P<0.05)；NVAF组和对照组IL-6基因-572G/C位点G等位基因频率比较，差异有统计学意义(OR=1.519，95%CI:1.087～2.122，P<0.05)，而在汉族及哈族对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)；年龄大于或等于75岁(OR=6.468，95%CI:2.427～17.240)、 左心房内径(OR=1.053，95%CI：1.022～1.085)，是发生房颤的独立危险因素；左心室射血分数(OR=0.946，95%CI:0.922～0.971)是防止房颤发生的保护因素。各组IL-6基因-174G/C位点 C、G等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0．05)。结论 IL-6-572G/C位点G等位基因是NVAF遗传易感性的危险因子，IL-6-174G/C位点的基因多态性与心房颤动的易感性无关。

非瓣膜性心房颤动；基因多态性；白细胞介素 6；民族差异

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床最常见的心律失常之一，一般人群发生AF率为0.4%～1.0%，80岁以上老年人的发生率高达9%[1]。有研究表明，炎症因子不仅可以在复律前预测复律的成功率，而且对复律后AF复发的预测有价值[1-2]。AF的发生和持续与白细胞介素(interleukin，IL)及其基因型明显相关。Terry等[3]报道指出IL-6-174G/C多态性中，C等位基因可增强IL-6的转录。郑金国等[4]报道指出IL-6-572C/G基因多态性中，G等位基因可增强IL-6的转录。本研究采用病例对照研究设计对新疆汉族及哈萨克族(哈族)人群中选取上述2个位点的多态性与非瓣膜性心房颤动(non-valvular atrial fibrillation，NVAF)易感性进行相关探讨，同时分析上述2个位点是否存在民族差异性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年1月至2011年8月在新疆医科大学第一附属医院心脏中心住院明确诊断为NVAF的汉族(n=79)、哈族(n=78)患者。纳入标准为NVAF患者有除风湿性心脏病以外的其他心脏病(如冠心病、充血性心肌病等)和全身性疾病(如高血压、甲状腺功能亢进、糖尿病等)而同时合并发生AF的汉族及哈族患者。对照组选取与病例组来自同一病区、无AF病史的汉族及哈族患者，所有的心电图(包括Holter)无AF表现的汉族(n=75)、哈族(n=79)患者。NVAF组和对照组均无血缘关系，无异族通婚家族史，排除合并瓣膜性心脏病、肝肾疾病、2周内外伤、炎症反应、风湿性疾病及恶性肿瘤患者。本研究已经获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，每例受试者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采集各组患者清晨空腹外周静脉血5 mL，装入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内-20 ℃冰箱保存,使用北京天根生化科技有限公司提供的血液基因组DNA 提取系统(RelaxGene Blood DNA System)提取基因组DNA。

1.2.2 引物的设计与合成 参照文献[3-4]方法设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。IL-6基因-174G/C位点引物序列，上游：5′-GCC AAA GTG CTG AGT CAC-3′，下游：5′-AAT CTT TGT TGG AGG GTG-3′；IL-6基因-572C/G位点引物序列，上游：5′-TGA AGC AGG TGA AGA AAG -3′，下游：5′-TTT CCT CTG ACT CCA TCG-3′。

1.2.3 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测 采用PCR扩增目的DNA片段,然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切,限制性内切酶识别并切割特异的序列,然后将酶切后的产物进行电泳,再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异切位点,即由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。基因扩增仪(Applied Biosystem 2720 Thermal Cyeler，美国应用生物系统公司)。PCR反应体系为20.0 μL:上下游引物各0.5 μL,2.5 mmol/L的MgCl23.0 μL，10×缓冲液3.0 μL，0.1 mmol/L的dNTP混合物3.0 μL，多聚酶0.5 U，模板DNA 2.0 μL，去离子水7.0 μL。PCR反应条件：IL-6-174G/C为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，进行40个循环；最后72 ℃延伸5 min。IL-6-572C/G为94 ℃预变性10 min，94 ℃变性60 s，58.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，进行32个循环；最后72 ℃延伸10 min。每批反应均以超纯水替代DNA作为阴性对照。

1.2.4 扩增产物限制性酶切 限制性内切酶均为Newlunberd公司产品。IL-6-174G/C扩增产物使用限制性内切酶NlaⅢ，20.0 μL酶切反应体系包括：10×缓冲液2.0 μL，PCR产物10.0 μL，10.0 U限制性内切酶0.5 μL,并加超纯水7.5 μL，37 ℃温浴9 h进行酶切。IL-6-572C/G扩增产物使用BsrBI限制性内切酶，20.0 μL酶切反应体系包括：10×缓冲液2.0 μL，PCR产物10.0 μL，10.0 U限制性内切酶0.5 μL，并加超纯水7.0 μL，37 ℃温浴11 h进行酶切。

1.2.5 基因型判定方法 IL-6-174G/C酶切产物以经3%琼脂糖在120 V电压下电泳40 min，IL-6-572C/G酶切产物以经2%琼脂糖在120 V电压下电泳30 min，在Gel Doc 2000紫外光凝胶电泳成像分析系统观察结果。每次酶切反应均以一个确定的纯合子基因型作为对照，基因分型结束后，随机抽取10%的样本进行重复分型，吻合率达100%。

2 结 果

2.1 IL-6基因多态性 在启动子-174位点发生了G→C基因替换，产生G、C两种等位基因。扩增产物片段大小为247 bp，经限制性内切酶消化后，电泳可见3种基因型。若该位点为C，则形成NlaⅢ酶切位点，即为等位基因C；反之，为等位基因G。酶切后得到226、21 bp两条片段为CC型；247、226、21 bp 3条片段为GC型；单条247片段为GG型(21 bp片段较小在电泳图上未显示)。IL-6基因在启动子-572位点发生了C→G基因替换，产生C、G两种等位基因。扩增产物片段大小为223 bp，经限制性内切酶消化后，电泳可见3种基因型。若该位点为G，则BsrBI形成酶切位点，即为等位基因G；反之，为等位基因C。酶切后得到154、69 bp两条片段为CC型；223、154、69 bp 3条片段为GC型；单条223片段为GG型(69 bp片段较小在电泳图上未显示)，见图1、2。

M:标记物；1、3、4、5：GG型；2：GC型。

图1 IL-6 -174G/C基因型分布

M:标记物；1、6、7：CG型；2、3：GG型；4、5：CC型。

图2 IL-6-572C/G基因型分布

2.2 各组患者的一般情况比较 NVAF组与对照组患者的一般资料比较，其中高龄(≥75岁)差异有统计学意义(P<0.05)；而平均年龄、性别、体质量指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、冠心病、心肌病的发生率差异均无统计学意义(P>0.05)。两组患者心脏超声结果中左心房内径(LAD)、左心室射血分数(EF)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；右心房内径(RAD)比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 NVAF与对照组患者的临床特征及心脏超声结果比较

续表1 NVAF与对照组患者的临床特征及心脏超声结果比较

2.3 Hardy-Weinberg平衡、等位基因及基因型频率比较 4组患者IL-6-174G/C基因多态性基因型中未出现CC型，GG型检出率为99.04%，GC型的检出率为0.96%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF组与对照组基因频率比较,差异无统计学意义(χ2=3.073，P>0.05)；汉族与哈族基因频率比较，差异无统计学意义(χ2=0.316P>0.05)，见表2。4组患者IL-6 -572C/G基因多态性基因型中实验中CC型、GC型、GG型检出率依次减少，分别为48.87%、34.41%、16.72%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF组与对照组基因频率比较,差异有统计学意义(χ2=6.018，P<0.05)；汉族与哈族基因频率比较，差异无统计学意义(χ2=0.008,P>0.05)，见表3。

2.4 多因素分析 将两组对比差异显著的危险因素进行Logistic回归分析，结果显示IL-6-572C/G等位基因频率在NVAF组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。说明G等位基因是非瓣膜性房颤的危险因子，与CC基因型相比，G等位基因存在能够增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)。同时高龄、LAD、EF、也与NVAF发生显著相关(P<0.05)，见表4。

表2 各组患者IL-6 -174G/C基因型和等位基因频率分布比较[n(%)]

表3 各组患者IL-6-572C/G基因型和等位基因频率分布比较[n(%)]

a:P<0.05，与哈族、汉族对照组比较。

表4 NVAF患者危险因素多因素非条件Logistic回归分析

3 讨 论

AF发病率近几年不断增加，其发生机制探讨也相对多元化，在不断深入研究中，学者们从遗传学角度，以基因多态性为切入点，开始对AF的发生机制进一步探讨。IL-6由T细胞及巨噬细胞产生，主要功能是诱导急性期反应蛋白如CRP、血清淀粉样蛋白-A等，IL-6基因定位于第7号染色体短臂2l区(7p21)内。有研究发现，IL-6基因启动子区域存在基因变异和基因多态性，这种多态性与AF的发生和维持密切相关[5-8]。同时，基因频率会因为种族、环境和地区不同等位基因的分布频率亦不同[9-10]。因此，研究基因多态性与AF的关系还需进行多种族多民族之间的对照研究。目前国内关于哈族AF基因方面研究报道较少,哈族与汉族人具有不同的遗传背景及生活习惯,研究哈族、汉族AF的基因多态性的特点将有助于探讨新疆地区哈族、汉族人群基因分布情况是否存在差异性。

目前已有研究表明，IL-6-174G/C基因多态性与NVAF有关，这种基因多态性的存在很可能导致IL-6的基因转录和表达水平在个体间有差异，从而影响IL-6的生物学水平及其作用，同时指出C等位基因可增强IL-6的转录[3]。本研究中发现，汉族及哈族人群中IL-6-174G/C位点只有GG和GC基因型，未见CC型，且基因型及等位基因在病例组和对照组的分布差异无统计学意义(P>0．05)，与国内报道相符[11]，故考虑IL-6-174G/C位点的变异与IL-6基因表达及NVAF的发生、发展没有明确的关系。研究还说明汉族及哈族IL-6-174G/C位点基因分布的差异无统计学意义(P>0.05)。同时，研究还指出汉族及哈族人群中IL-6-174G/C基因多态性与欧美人种具有不同的频率分布特征，与日本人群C等位基因频率为0基本一致[12-13]。

有研究报道，IL-6-572C/G位点G等位基因频率在AF组分布明显高于对照组，IL-6-572C/G位点突变的G等位基因可能通过基因调控促进IL-6的高度表达，使血清IL-6水平升高，使机体处于高炎症状态[4]。本研究发现，汉族及哈族人群中IL-6-572C/G位点CC型、GC型、GG型检出率依次为48.87%、34.41%、16.72%，NVAF组与对照组基因频率比较差异有统计学意义(χ2=6.018，P<0.05)，Logistic回归分析示G等位基因存在能够增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)，G等位基因是NVAF的危险因子。同时，研究还说明汉族及哈族IL-6-572C/G位点基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。故IL-6-572C/G位点G等位基因可能是新疆地区汉族及哈族AF发病的遗传易感基因。IL-6多态位点基因分型检测能在一定程度上预测AF发病风险，并可为AF防治提供新途径。

本研究一般资料对比中发现，患者高龄(≥75岁)，OR=6.468，95%CI:2.427～17.240(P<0.01)，考虑高龄是发生AF的危险因素之一，与国内外研究基本相符合，高龄的患者所导致NVAF发生的原因有很多，LAD逐渐扩大，左心耳流速减慢可能是导致NVAF发生率上升的明显原因[14-15]。本研究结果显示，NVAF组与对照组相比，LAD大于对照组OR=1.053，95%CI:1.022～1.085(P<0.01)，说明了AF诱发间质纤维化、肌原纤维丢失、糖原积聚及细胞连接结构紊乱等亚细胞结构改变，导致心房直径增加。同时，NVAF组EF低于对照组OR=0.946，95%CI:0.922～0.971(P<0.01)。说明EF是防止AF发生的保护因素，EF越高患者越不易发生AF。AF时心房肌有效收缩丧失，使舒张期充盈减少及心室收缩功能降低，进一步减少左心室血液充盈及EF。

综上所述，本研究发现IL-6-572C/G位点G等位基因是NVAF遗传易感性的危险因子，但在汉族及哈族人群中分布差异无统计学意义(P>0.05);IL-6基因-174G/C位点的多态性与AF的易感性无关，在汉族及哈族人群中分布差异无统计学意义(P>0.05)，同时高龄(≥75岁)、LAD是发生AF的危险因素。EF是防止AF发生的保护因素，EF越高患者越不易发生AF。作者通过分析研究数据得出比较客观的结果，从而为NVAF危险因素及易感性的分子生物学机制深入研究提供方向。

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Analysis on IL-6-174G/C and -572C/G site gene polymorphism and non-valvular atrial fibrillation population in Xinjiang and national differences*

LiNa,WangShuxia,MuhuYati△

(DepartmentofPhysicalExamination,HealthManagementCenter,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi,Xinjiang830054,China)

Objective To investigate the relationship between IL-6-174C/G and-572C/G site gene polymorphism with non-valvular atrial fibrillation(NVAF) as well as the national differences of interleukin-gene polymorphism between Kazak and Han nationality in Xinjiang region.Methods Seventy-nine Kazak patients of NVAF(Kazak NVAF group),78 Han patients with NVFA (Han NVAF group),75 Han cases of non-AF and 79 Kazak cases of non-AF were selected in Xinjiang region.The venous bloods were collected from extracting DNA.IL-6 gene -174G/C and -572C/G polymorphism in various groups were analyzed by adopting the PCR-RFLP technique.Results The allele frequency of IL-6 -572G/C site G in the NVAF group was significantly higher than that in the control group(χ2=4.076,P<0.05).The allele frequency of IL-6 gene -572 G/C site G had statistical difference between the NVAF group and the control group(OR=1.519，95%CI:1.087-2.122，P<0.05),but the distribution difference between the Han and Kazak control groups had no statistical significance(P>0.05);the advanced age ≥75 years old)(OR=6.468，95%CI:2.427-17.240) and left atrial dimension(OR=1.053，95%CI:1.022-1.085) were the independent factors of AF occurrence;the left ventricular ejection fraction was a protective factor for preventing AF occurrence.The allele frequency of IL-6 gene 174G/C site C and G had no statistical difference among various groups(P>0.05).Conclusion The allele of IL-6-572 G/C site G is a risk factor of genetic predisposition in NVAF.IL-6-174G/C site gene polymorphism has no relation with the susceptibility of AF.

non-valvular atrial fibrillation;gene polymorphism;interleukin 6;national difference

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.004

国家自然科学基金资助项目(81260036)；中华医学会医学教育分会中国高等教育学会医学教育专业委员会医学教育研究项目(2016BQK022)；新疆维吾尔自治区科技计划软科学项目(2016D07014)。 作者简介：李娜(1986-)，住院医师， 硕士研究生，主要从事心血管疾病的诊治研究。△

，E-mail：muhuyati@163.com。

R541.75

A

1671-8348(2017)07-0875-04

2016-09-11

2016-11-30)